Klinisch-experimentelle Analyse zur Expression von IDO1 und TREM2 in Blut- und Gewebeproben von Patienten mit oralem Plattenepithelkarzinom

Abstract

Hintergrund: Trotz multimodaler Therapiekonzepte hat die 5-Jahres-Überlebensrate des oralen Plattenepithelkarzinoms (oral squamous cell carcinoma, OSCC) in den letzten Jahrzehnten bei 53,7% stagniert. Das Hauptaugenmerk der aktuellen onkologischen Grundlagenforschung liegt daher auf der Identifizierung tumorspezifischer Marker, die für die Entwicklung von neuen diagnostischen und individualisierten, zielgerichteten therapeutischen Strategien eingesetzt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bedeutung von Indolamin-2,3-dioxygenase 1 (IDO1) und Triggering receptor expressed on myeloid cells type 2 (TREM2) beim OSCC untersucht, denen beiden ein hoher Stellenwert in der tumorinitiierten Immunsuppression zugeschrieben wird.

Methodik: Im ersten Teil dieser Arbeit erfolgten immunhistochemische Färbungen zum Nachweis der Expression von IDO1 und TREM2 im Tumorgewebe sowie korrespondierenden Lymphknotenmetastasen, um diese auf eine potentielle Korrelation mit klinischen und histopathologischen Parametern sowie eine mögliche prognostische Relevanz zu untersuchen. Im zweiten Schritt galt es, Makrophagen auf eine mögliche Expression von IDO1 und TREM2 zu analysieren. Hierfür wurde Tumor- sowie gesundes Nachbargewebe dissoziiert und in Einzelzellsuspensionen überführt sowie periphere mononukleäre Zellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) isoliert und anschließend mittels Durchflusszytometrie auf die Expression der Makrophagenmarker CD68, CD163 und CD206 überprüft. Soluble TREM2 (sTREM2, Shedding- bzw. alternatives Splicingprodukt von TREM2) und die IDO1-Aktivität (gemessen als Kynurenin/Tryptophan-Ratio) wurden als serologisch bestimmbare Tumormarker untersucht.

Ergebnisse: Eine hohe epitheliale IDO1-Expression in Primärtumoren zeigte eine signifikante Assoziation mit dem weiblichen Geschlecht (Spearman‘s rank correlation coefficient (SRC), p=0,046), einem Alter ≤ 75 Jahre (SRC, p=0,017), den niedrigen Union internationale contre le cancer (UICC)-Stadien (SRC, p<0,001) sowie dem Auftreten eines Rezidivs (SRC, p=0,021). Eine hohe IDO1-Expression in Immunzellen der Primärtumore korrelierte signifikant mit dem weiblichen Geschlecht (SRC, p=0,006), einem Alter > 75 Jahre (SRC, p=0,019) sowie hohen UICC-Stadien (SRC, p=0,026). Die IDO1-Expression in Epithelzellen der Primärtumore zeigte in der Univariat-Analyse einen signifikanten Einfluss auf das progressionsfreie Überleben (Hazard Ratio (HR): 2,544; 95% confidence interval (9%CI): 1,259-5,139; p=0,009) und das Gesamtüberleben (HR: 2,817; 95%CI: 1,428-5,558; p=0,009). In der Multivariat-Analyse konnte ein annähernd signifikanter Einfluss auf die Rezidivwahrscheinlichkeit festgestellt werden (HR: 2,073; 95%CI: 0,959-4,479; p=0,064). Die IDO1-Expression in Immunzellen der Primärtumore wies in der Univariat-Analyse hingegen einen signifikanten Einfluss auf das progressionsfreie Überleben (HR: 1,483; 95%CI: 1,029-2,137; p=0,029) sowie einen annähernd signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben auf (HR: 1,428; 95%CI: 0,985-2,070; p=0,054). In der Multivariat-Analyse wurde die IDO1-Expression in Immunzellen als annähernd signifikanter unabhängiger Einflussfaktor auf das progressionsfreie Überleben bestätigt (HR: 1,416; 95%CI: 0,967-2,074; p=0,074). Bei der Auswertung der TREM2-Expression in Immunzellen der Primärtumore zeigte sich, dass diese positiv mit dem weiblichen Geschlecht (SRC, p=0,021), den UICC-Stadien (SRC, p=0,040) und der PD-L1-Expression korreliert (SRC, p<0,001). Zudem wiesen Patienten mit einer hohen TREM2-Expression signifikant häufiger einen Tumorprogress auf (Multivariat-Analyse, HR: 2,17; 95%CI: 1,021-4,613; p=0,044) und zeigten ein signifikant geringeres Gesamtüberleben (Multivariat-Analyse, HR: 2,548; 95%CI: 1,089-5,964; p=0,031). Eine hohe TREM2-Expression in Immunzellen von Lymphknotenmetastasen korrelierte mit dem weiblichen Geschlecht (SRC, p=0,008), einem Alter > 75 Jahre (SRC, p=0,042) und einer hohen PD-L1-Expression (SRC, p<0,001). Die TREM2-Expression in Immunzellen der Lymphknotenmetastasen zeigte in der Multivariat-Analyse hinsichtlich des progressionsfreien Überlebens einen annähernd signifikanten Einfluss (HR: 4,904; 95%CI: 1,003-23,987; p=0,050). Die IDO1- und TREM2-Expression auf Makrophagen der PBMCs nahm mit zunehmendem UICC-Stadium zu und war im Allgemeinen höher als in der Kontrollkohorte. Der Anteil IDO1-exprimierender Zellen an den CD68+- und CD163+-Zellen war im Tumorgewebe hochsignifikant höher als im gesunden Nachbargewebe (t-Test, p<0,0001). Im Gegensatz dazu konnte ein vergleichbarer IDO1+-Anteil der CD68+CD163+-Zellen zwischen Tumor- und gesundem Nachbargewebe festgestellt werden (t-Test, p=0,924). Auch die Anteile TREM2-exprimierender Immunzellen waren zwischen Tumor- und Nachbargewebe vergleichbar (t-Test, p>0,05). Die Kynurenin- und Tryptophan-Konzentrationen sowie ihre Ratio unterschieden sich signifikant zwischen Patienten mit und ohne Lymphknotenmetastasen (t-Test, p<0,05). Die Kynurenin/Tryptophan-Ratio korrelierte signifikant mit der IDO1-Expression der PBMCs (SRC, p<0,05). Die sTREM2-Konzentration korrelierte mit dem Fortschritt der malignen Erkrankung, ohne das Signifikanzniveau zu erreichen (SRC, UICC-Stadium: p=0,059).

Schlussfolgerung: IDO1 und TREM2 konnten als Biomarker des OSCCs verifiziert werden und könnten im Rahmen der Therapieindividualisierung (personalisierte Medizin) zur Therapiestratifizierung und -optimierung beitragen. Hierbei könnten vor allem Patienten in fortgeschrittenen UICC-Stadien von einer gegen die Marker gerichteten Immuntherapie profitieren. Nach klinischer Revalidierung könnte die Kynurenin/Tryptophan-Ratio (als Surrogat der IDO1-Aktivität) zukünftig zur Therapiestratifizierung von Patienten mit lokoregionär metastasiertem OSCC unter Berücksichtigung individueller Risikoprofile in die Routinediagnostik implementiert werden.

Background: Despite multimodal therapy concepts, the 5-year survival rate for oral squamous cell carcinoma (OSCC) has stagnated at 53.7% in recent decades. The focus of current oncological basic research is therefore on the identification of tumor-specific markers that can be used for the development of new diagnostic and individualized, targeted therapeutic strategies. In this work, the importance of indolamine-2,3-dioxygenase 1 (IDO1) and triggering receptor expressed on myeloid cells type 2 (TREM2) in OSCC was investigated, both of which are considered to be of great importance in tumor-initiated immunosuppression.

Methods: In the first part of this work, immunohistochemical staining was performed to detect the expression of IDO1 and TREM2 in the tumor tissue and the corresponding lymph node metastases in order to identify a correlation with clinical and histopathological parameters and a potential prognostic relevance. The second step was to investigate a possible expression of IDO1 and TREM2 in macrophages. For this purpose, tumor and healthy adjacent tissue were dissociated and transferred into single cell suspensions, and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated and then investigated for the expression of the macrophage markers CD68, CD163 and CD206 by flow cytometry. Soluble TREM2 (sTREM2, shedding or alternative splicing product of TREM2) and IDO1 activity (measured as kynurenine/tryptophan ratio) were investigated as serologically determinable tumor markers.

Results: Immunohistochemical staining showed that high epithelial IDO1 expression in the primary tumors was significantly associated with female sex (Spearman's rank correlation coefficient (SRC), p=0.046), age ≤ 75 years (SRC, p=0.017), the lower Union international contre le cancer (UICC) stages (SRC, p<0.001) and the risk of recurrence (SRC, p=0.021). High IDO1 expression in immune cells of the primary tumors correlated significantly with female sex (SRC, p=0.006), age > 75 years (SRC, p=0.019), and more advanced UICC stages (SRC, p=0.026). In univariate analysis, IDO1 expression in epithelial cells of the primary tumors showed a significant influence on progression-free survival (hazard ratio (HR): 2.544; 95% confidence interval (95%CI): 1.259-5.139; p=0.009) and overall survival (HR: 2.817, 95%CI: 1.428-5.558, p=0.009). In the multivariate analysis, it almost reached statistical significance on the probability of recurrence (HR: 2.073; 95%CI: 0.959-4.479; p=0.064). In the univariate analysis, however, IDO1 expression in immune cells of the primary tumors showed a significant influence on progression-free survival (HR: 1.483; 95%CI: 1.029-2.137; p=0.029) and an almost significant influence on overall survival (HR: 1.428, 95%CI: 0.985-2.070, p=0.054). In multivariate analysis, IDO1 expression was confirmed to be an approximately significant independent factor influencing progression-free survival (HR: 1.416; 95%CI: 0.967-2.074; p=0.074). Analysis of TREM2 expression in immune cells of the primary tumors showed a positive correlation with female gender (SRC, p=0.021), UICC stage (SRC, p=0.040) and PD-L1 expression (SRC, p<0.001). In addition, patients with high TREM2 expression showed significantly increased risk for tumor progression (multivariate analysis, HR: 2.17; 95%CI: 1.021-4.613; p=0.044) and showed a significantly lower overall survival (multivariate analysis, HR: 2.548, 95%CI: 1.089-5.964, p=0.031). High TREM2 expression in immune cells of lymph node metastases correlated with female gender (SRC, p=0.008), age > 75 years (SRC, p=0.042), and high PD-L1 expression (SRC, p<0.001). In the multivariate analysis, TREM2 expression in immune cells of the lymph node metastases showed an almost significant influence on progression-free survival (HR: 4.904; 95%CI: 1.003-23.987; p=0.050). IDO1 and TREM2 expression on macrophages of the PBMCs increased with increasing UICC stage and was generally higher than in the control cohort. The proportion of IDO1+- cells in the CD68+- and CD163+-cells was significantly higher in the tumor tissue than in the healthy adjacent tissue (t-test, p<0.0001). In contrast, a comparable IDO1-expressing proportion of CD68+CD163+-cells could be determined between tumor and healthy adjacent tissue (t-test, p=0.924). The proportions of TREM2-expressing immune cells were also comparable between tumor and adjacent tissue (t-test, p>0.05). The kynurenine and tryptophan concentrations as well as their ratio differed significantly between patients with and without lymph node metastases (t-test, p<0.05). The kynurenine/tryptophan ratio correlated significantly with the IDO1 expression of the PBMCs (SRC, p<0.05). The sTREM2 concentration correlated with the progression of the malignant disease, but the level of significance was just missed (SRC, UICC stage: p=0.059).

Conclusion: IDO1 and TREM2 could be verified as biomarkers of OSCC and could be used in the context of therapy individualization (personalized medicine) for therapy stratification and optimization. Patients in advanced UICC stages in particular could benefit from an immunotherapy targeting IDO1 or TREM2. After clinical revalidation, the kynurenine/tryptophan ratio (as a surrogate of IDO1 activity) could be implemented in routine diagnostics for therapy stratification of patients with locoregional metastatic OSCC, taking into account individual risk profiles.