Analyse der Immunzellinfiltration des Tumormikromilieus und seiner prognostischen Relevanz bei Patienten mit einem Plattenepithelkarzinom des Kopf-Hals-Bereichs

Abstract

Plattenepithelkarzinome der Kopf-Hals-Region (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) stellen mit jährlich 550.000 neu diagnostizierten Erkrankungen und 380.000 Todesfällen im Jahr die sechs häufigste Krebserkrankung der Welt dar. Trotz intensiver Bemühungen konnte die 5 Jahres-Überlebensrate mit circa 55% in den letzten Jahrzehnten nicht wesentlich verbessert werden. Vor dem Hintergrund einer wachsenden Bedeutung der Immuncheckpoint-Inhibition im Behandlungsspektrum von Kopf-Hals-Tumorpatienten gewinnen immunologische Prozesse im Tumormikroenvironment (TME) zunehmend an Bedeutung in der Kopf- und Hals-Onkologie. Trotz konstanter Verbesserung der Analysemethoden für umfassende Untersuchungen des immunologischen TMEs in den letzten Jahren bleibt die prognostische Relevanz der Zusammensetzung der Immunzellen im Tumormikromilieu von Kopf-Hals-Krebs weitgehend unklar. Ursache hierfür ist eine Begrenzung der meisten Studien auf eine oder eine kleine Untergruppe von Immunzellen und ein heterogenes Patientenkollektiv. In der vorliegenden wissenschaftlichen Arbeit wurden vor diesem Hintergrund 29 zelluläre und humorale Immun-Biomarker basierend auf RNA Sequenzierungs-Daten des TCGA-Projekts (The Cancer Genome Atlas) für Kopf-Hals-Tumorpatienten (TCGA-HNSC) untersucht. Zur Validierung wurden die sechs Zellpopulationen mit der höchsten prognostischen Relevanz an einem eigenen HNSCC-Patientenkollektiv validiert. Das Gesamtüberleben (OS) der TCGA-HNSC Kohorte, die n=513 Kopf-Hals-Karzinom-Patienten umfasst, wurde in Abhängigkeit von 29 verschiedenen Immun-Biomarkern, darunter ein breites Spektrum von Immunzell-Subpopulationen sowie Immun-Checkpoint-Rezeptoren und Zytokine unter Verwendung eines RNAseq-Dekonvolutionsalgorithmus analysiert. Die signifikantesten Prädiktoren für das Überleben der 29 Immunparameter wurden an einer separaten HNSCC-Patientenkohorte (n=101) mittels Immunhistochemie semiquantitativ analysiert und mit dem Gesamtüberleben korreliert. Im Zuge der Validierung erfolgten die immunhistochemischen Färbungen mit Antikörpern geríchtet gegen die Immunmarker CD3 (T-Zellen), CD20+CXCR5 (naive B-Zellen), CD4+CXCR5 (T-follikuläre Helferzellen), Foxp3 (Treg-Zellen) und CD68 (Makrophagen). Die Gesamtimmunaktivität und -infiltration, gemessen durch den CYT- und ESTIMATE Immune Score zeigte unabhängig ihrer Zusammensetzung keine signifikante Korrelation mit dem Gesamtüberleben der Patienten in der TCGA-HNSC-Kohorte. Durch die Fokussierung auf einzelne Immunzell-Subpopulationen konnte ein gesteigerter Gehalt an naiven B-Zellen (p=0,0006), follikulären T-Helferzellen (p<0,0001), Makrophagen (p=0,0042), regulatorischen T-Zellen (p=0,0306), Lymphozyten (p=0,0001) und zytotoxischen T-Zellen (p=0,0242) im Tumormikroenvironment als hochsignifikante Prädiktoren für ein verbessertes Patientenüberleben identifiziert werden. Der immunhistochemische Nachweis dieser Immunzellen in einer zweiten unabhängigen Validierungskohorte von n=101 HNSCC-Patienten konnte diese prognostische Relevanz für follikuläre T-Helferzellen, zytotoxische T-Zellen und Lymphozyten bestätigen. In einer Multivarianzanalyse konnten über die Immunzellpopulationen hinaus ein negativer HPV-Tumorstatus, sowie fortgeschrittene UICC-Stadien als zusätzliche prognostische Biomarker identifiziert werden, die mit einem schlechten Outcome assoziiert waren. Die prognostischen Analysen konnten weiterhin eine Tendenz zu einem verbesserten Gesamtüberleben im Falle einer ausreichenden Vitamin-D-Versorgung der Patienten zeigen. Neben der prognostischen Bedeutsamkeit des HPV-Tumorstatus konnte eine signifikante Korrelation der HPV-Positivität mit einer verstärkten Immunzellinfiltration durch naive B-Zellen gezeigt werden. Die vorliegende wissenschaftliche Arbeit unterstreicht somit die prognostische Relevanz des immunologischen Tumor microenvironment bei Kopf-Hals-Tumoren und zeigt, dass eine detaillierte Analyse der Immunzellzusammensetzung und der Immunzellsubtypen notwendig ist, um valide Rückschlüsse auf die Prognose der Patienten zu erhalten. Dabei zeigten Lymphozyten, zytotoxische T-Zellen und follikuläre T-Helferzellen auf der Grundlage unserer Daten die höchste prognostische Relevanz. Diese Ergebnisse motivieren zu weiteren Untersuchungen der spezifischen Immunzellsubpopulationen als Prädiktoren für die Prognose der betroffenen Patienten, sowie darüber hinaus als vielversprechende Ziele für neue immuntherapeutische Strategien.

Dealing with 550,000 new diseases and 380,000 deaths per year head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer worldwide. Despite intensive efforts, the 5-year survival rate of approximately 55% has not been significantly improved in recent decades. Due to the increasing value of immune checkpoint inhibition in the therapeutic management of head and neck squamous cell carcinoma, immunological processes in the tumor microevironment (TME) are increasingly gaining importance in the field of head and neck oncology. Though analytical methods for a comprehensive analysis of the immunological TME have constantly improved and expanded over the past years the prognostic relevance of immune cell composition in head and neck cancer TME largely remains ambiguous with most studies focusing on one or a small subset of immune cells and a heterogenous patient population. Therefore, in the present scientific work, 29 cellular and humoral immune biomarkers based on RNA sequencing data of the TCGA atlas were analyzed. For validation, the six cell populations with the highest prognostic relevance were validated in an own HNSCC patient collective. The overall survival (OS) of the TCGA-HNSC patient cohort comprising 513 head and neck cancer patients was correlated with a total of 29 different immune metrics including a wide spectrum of immune cell subpopulations as well as immune checkpoint receptors and cytokines using RNAseq based immune deconvolution analyses. The most significant predictors of survival among these 29 immune metrics were validated on a separate HNSCC patient cohort (n=101) using immunohistochemistry. The immunohistochemical staining included antibodies against the immune marker: CD3 (T cells), CD20+CXCR5 (naive B cells), CD4+CXCR5 (T follicular helper cells), Foxp3 (Treg cells), and CD68 (macrophages). Overall immune infiltration irrespective of immune cell composition showed no significant correlation with the patients’ overall survival in the TCGA-HNSC cohort. However, when focusing on different immune cell subpopulations, an increased level of naive B cells (p=0.0006), follicular T-helper cells (p<0.0001), macrophages (p=0.0042), regulatory T cells (p=0.0306), lymphocytes (p=0.0001), and cytotoxic T cells (p=0.0242) in the tumor microenvironment were identified as highly significant predictors of improved patient survival. Using immunohistochemical detection of these immune cells in a second independent validation cohort of n=101 HNSCC patients could confirm prognostic relevance for follicular T helper cells, cytotoxic T cells and lymphocytes. In multivariate analysis, beyond immune cell populations, HPV negativity and advanced UICC stages were identified as additional prognostic biomarkers associated with poor outcome. The prognostic analyses could further show a tendency towards improved overall survival in case of sufficient vitamin D supply of the patient. In addition to the prognostic influence of HPV tumor status, HPV positivity could show a significant correlation to an increased immune cell infiltration of naive B cells. Therefore, our study highlights the prognostic relevance of immunological tumor environment in head and neck cancer and demonstrates that a more detailed analysis of immune cell composition and immune cell subtypes is necessary to get valid conclusions on patient outcome. Thereby, lymphocytes, cytotoxic T cells, and follicular t helper cells showed the highest prognostic relevance based on our data, which motivates to further investigations focusing on these specific immune cell subpopulations not only as predictors of patient prognosis but also as promising targets of new immunotherapeutic strategies.