Intrazellulärer Interferon-Gamma-Transport und Interferon-Gamma-Sekretion in aktivierten CD8-T Lymphozyten

Abstract

CD8+ cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) are important guardians to protect us from infection and disease by killing viral-infected cells and tumor cells. The effector mechanisms of CTLs are composed of perforin (Prf) and granzyme B (GzmB) causing targets death and Fas/FasL interaction inducing targets apoptosis. Besides the effector function, CTLs have immunosurveillance and immunomodulatory functions by producing and secreting Interferon-gamma (IFNγ). IFNγ and TNF alpha (TNFα) mediated anti-microbe and anti-tumor effects. IFNγ binds to the Interferon-gamma receptors (IFNGRs) on the surrounding cells’ surface and triggers the IFNγ-signaling pathway which can induce a series of effects on immune cells. My thesis aims to understand under which conditions IFNγ is produced by CTLs and how it is released to the extracellular space. We showed that IFNγ was tremendously produced in CTLs upon a few hours of anti-CD3ε restimulation and the more mature the CTLs were, the faster IFNγ was produced. The effector memory and effector T-lymphocytes were the major sources of IFNγ. Though it had been shown that IFNγ was directed to and secreted at the immunological synapse (IS) from T-lymphocytes, the trafficking and secretion process of IFNγ hadn't been well-studied yet in CD8+ CTLs. In my thesis, it was described by quantification of the intracellular and supernatant IFNγ that both IFNγ-production and IFNγ-secretion were regulated by TCR/CD3ε engagement. Most of the IFNγ shared a common secretion process with GzmB upon an anti-CD3ε restimulation as I could show by using structured illumination microscopy (SIM), correlative light and electron microscopy (CLEM), and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M). Using GzmB-mTFP KI mice, we found that IFNγ extensively colocalized with GzmB-containing vesicles, most of which compartmentalized in dark core (DC) and amorph vesicles. In addition, we observed that usually IFNγ and GzmB were secreted together by the same vesicle to the IS. IFNγ could be released from multi-core granules (MCGs) besides single-core granules (SCGs) and more interestingly, it was also found in supramolecular-attack-particles (SMAPs). Using a Munc13-4 knockout mouse, we demonstrated that Munc13-4, a SNARE-associated protein involved in CGs trafficking and priming, was also a critical factor for IFNγ secretion. Munc13-4 knockout resulted in a deficiency of IFNγ and GzmB secretion. In summary, I was able to show for the first time that IFNγ has an identical secretion pathway to GzmB and occurs together with GzmB in SMAPs and reclassified MCGs alongside SCGs, and it is released at the IS. In addition to the already known secretion deficiency for GzmB in Munc13-4 knockout mice, to the best of our knowledge, for the first time, IFNγ secretion is also abrogated in Munc13-4 KO mice.

CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) sind wichtige Wächter des Immunsystems, die uns vor Infektionen und Krankheiten schützen, indem sie virusinfizierte Zellen und Tumorzellen abtöten. Die Effektormechanismen von CTLs bestehen aus der Sekretion der zytotoxischen Substanzen Perforin (Prf) und Granzym B (GzmB) und der Fas Ligand und Fas Rezeptor (Fas/FasL)-Interaktionen, welche die Apoptose der Zielzellen induzieren. Neben der Effektorfunktion haben CTLs Immunüberwachungs- und immunmodulatorische Funktionen, indem sie Zytokine, wie IFNγ produzieren und sezernieren. IFNg und TNF-alpha (TNFα) haben hierbei anti-mikrobielle und anti-Tumor Wirkungen. IFNγ bindet an die Interferon-Gamma-Rezeptoren (IFNGRs) auf der Oberfläche der umgebenden Zellen und löst den IFNγ-Signalweg aus, welcher eine Reihe von Wirkungen auf Immunzellen hat. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, zu verstehen, unter welchen Bedingungen IFNγ von CTLs produziert wird und wie es in den extrazellulären Raum abgegeben wird. Wir zeigten, dass IFNγ in CTLs nach einigen Stunden Anti-CD3ε-Restimulation in enormen Mengen produziert wurde, Dabei korrelierte der Reifestand der Lymphozyten positiv mit der Fähigkeit IFNγ zu produzieren. Effektor-Memory oder Effektor Lymphozyten waren die größten Quellen von IFNγ. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass IFNγ von T-Lymphozyten zur Immunologische Synapse (IS) geleitet und dort sezerniert wird, war der Transport- und Sekretionsprozess von IFNγ in CD8+-CTLs bislang noch nicht gut untersucht. In meiner Dissertation wurde durch Quantifizierung des intrazellulären und sekretierten IFNγ beschrieben, dass sowohl die IFNγ-Produktion als auch die IFNγ-Sekretion durch TCR/CD3ε-Engagement reguliert werden. Der größte Teil des IFNγ teilte einen gemeinsamen Sekretionsprozess mit GzmB nach einer Anti-CD3ε-Restimulation, wie ich durch die Verwendung von strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM), korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) und Fluoreszenzmikroskopie mit totaler interner Reflexion (TIRF-M) zeigen konnte. Unter Verwendung von GzmB-mTFP-KI-Mäusen fanden wir heraus, dass IFNγ überwiegend mit GzmB-enthaltenden Vesikeln kolokalisiert ist. Außerdem beobachteten wir, dass IFNγ und GzmB gemeinsam an der IS sezerniert werden. IFNγ konnte nicht nur aus Single core granules (SCGs), sondern auch aus Multi-Core-Granulen (MCGs) freigesetzt werden und es wurde interessanterweise in „Supramolecular-Attack-Particles“ (SMAPs) gefunden. Durch die Verwendung einer Munc13-4-Knockout-Maus könnte ich zeigen, dass Munc13-4, ein SNARE-assoziiertes Protein, das am Transport und Priming von CGs beteiligt ist, notwendig für die IFNγ-Sekretion ist. Der Knockout von Munc13-4 führte zu einer Reduzierung der IFNγ- und GzmB-Sekretion. Zusammenfassend konnte ich zum ersten Mal zeigen, dass IFNγ einen identischen Sekretionsweg wie GzmB hat und zusammen mit GzmB in SMAPs und reklassifizierten MCGs neben SCGs vorkommt und in der IS freigesetzt wird. Neben dem bereits bekannten Sekretion Mangel für GzmB in Munc13-4-Knockout-Mäusen wird unseres Wissens nach erstmals auch die IFNγ-Sekretion in Munc13-4-KO-Mäusen außer Kraft gesetzt.