Frühe Veränderungen von Schlüsselproteinen der Endozytose in Photorezeptorsynapsen der CSPα-Knockout Maus

Abstract

CSPα is a presynaptic vesicle protein that plays an important role as a chaperone protein (protein folding helper) in the terminals of nerve endings. The main task of CSPα is to maintain the continuous functionality of synaptic proteins and, thus, of the processes in the presynaptic terminals. The chaperone function is especially important for highly active synapses, such as the tonically active photoreceptor synapses. The absence of CSPα in CSPα- knockout mice, therefore, leads to progressive neurodegenerative changes in the photoreceptor synapse which can lead to blindness. The ability of CSPα to prevent neurodegenerative processes and to ensure the continuous functioning of synapses has so far been investigated primarily with regard to its role in exocytosis. CSPα promotes the incorporation of the protein SNAP-25 into the SNARE complex. The work presented in this paper focuses on the question of whether CSPα is equally important for maintaining endocytosis in the high- speed active photoreceptor synapses. To investigate this, key endocytotic proteins, Clathrin and Dynamin, were immunolabeled at different early stages of postnatal retinal development (from postnatal day 14 to 16) using double immunofluorescence staining. Retinal specimen from CSPα knockout mice and CSPα wild-type mice were compared. The primary antibodies used were Anti-Clathrin 7A9, Anti-Dynamin 1E10 and Anti- PSD-95 antibodies. As a positive control, an antibody against the ribbon synapse protein Ribeye (Anti- Ribeye 2D9) was used as the primary antibody. It is known that the synaptic ribbons are severely affected by a CSPα deficit. Immune labeling with an antibody against the protein PSD-95 served as a guide to visualize the position of the photoreceptor synapses and to use it as a reference antibody. To show the course of the synapse changes, semithin sections (0.5 μm) of mice from postnatal days 14 to 16 were analyzed in comparison between knockout and wild-type mice from the same litter. The preparations used all derive from the time after the eyes have opened. Eye opening usually happens around the 10th-12th postnatal day. We examined the postnatal development of the mentioned endocytic proteins during this early period by means of immunofluorescence microscopy of the photoreceptor synapses in the outer plexiform layer, comparing knockout and control. A reduced signal intensity was evident in the microscopic analysis of the endocytic proteins Dynamin and Clathrin as early as on postnatal day 14. The immune signals in the outer plexiform layer for Dynamin had almost disappeared by postnatal day 16. For Clathrin, a clear drop in the corresponding immune signals was evident over the course of the three days surveyed. These observations confirm the hypothesis that CSPα actions are not limited to exocytosis but also comprise endocytotic processes. The endocytic proteins Clathrin and Dynamin are clearly affected by a CSPα knockout and could therefore be substrates of the CSPα along with many other proteins such as SNAP-25.

CSPα ist ein präsynaptisches Vesikelprotein, welches als Chaperon (Proteinfaltungshelfer) in den präsynaptischen Terminalen von Nervenzellen von Bedeutung ist. Die Aufgabe des Chaperons CSPα besteht insbesondere darin, die kontinuierliche Funktionsfähigkeit synaptischer Proteine zu erhalten und damit die Vorgänge der präsynaptischen Terminalen zu gewährleisten. Für besonders aktive Synapsen, zu denen man die tonisch aktiven Photorezeptorsynapsen zählt, ist vor allem die Chaperonenfunktion wichtig. Die Abwesenheit von CSPα in der CSPα-Knockout-Maus führt zu schweren, schnell fortschreitenden neurodegenerativen Veränderungen in der Photorezeptorsynapse, durch die es bis zur Erblindung kommt. Die Fähigkeit von CSPα, neurodegenerativen Prozessen vorzubeugen und die fortlaufende Aktivität von Synapsen zu sichern, wurde bisher vor allem bezüglich seiner Rolle in der Exozytose untersucht. Hierbei fördert CSPα den Einbau des Proteins SNAP-25 in den SNARE-Komplex der Exozytose. Im Fokus dieser Arbeit steht die Frage, ob CSPα vergleichbar wichtig für die Aufrechterhaltung der Endozytose in den besonders aktiven Photorezeptorsynapsen ist. Um dies zu überprüfen wurden mithilfe von Doppelimmunfluoreszenzuntersuchungen Schlüsselproteine der Endozytose, Clathrin und Dynamin, in unterschiedlichen frühen Stadien der postnatalen Retinaentwicklung immunmarkiert (vom 14. postnatalen Tag bis zum 16. postnatalen Tag) und Retinapräparate von CSPα-Knockout-Mäusen und CSPα-Wildtyp-Mäusen vergleichend betrachtet. Bei den verwendeten Primärantikörpern handelte es sich um die Antikörper Anti-Clathrin 7A9, Anti-Dynamin 1E10 und Anti-PSD-95. Zur Positivkontrolle wurde ein Antikörper gegen das Ribbonsynapsenprotein Ribeye (Anti-Ribeye 2D9) als Primärantikörper eingesetzt. Ribeye ist die Hauptkomponente der Ribbonsynapsen, welche stark von einem CSPα-Defizit beeinträchtigt werden [59]. Die Immunmarkierung mit einem Antikörper gegen das Protein PSD-95 diente als Orientierung, um die Position der Photorezeptorsynapsen sichtbar zu machen und wurde als Referenzantikörper verwendet. Zur Darstellung eines Verlaufes der Synapsenveränderungen wurden Semidünnschnitte (0,5 μm) von Mäusen der postnatalen Tage 14 bis 16 jeweils im Vergleich zwischen Knockout- und Wildtyp-Maus aus dem gleichen Wurf analysiert. Die verwendeten Präparate stammten somit alle von einem Zeitpunkt nach der Augenöffnung, die meist zwischen dem 10. bis 12. postnatalen Tag stattfindet. In diesem frühen Zeitraum wurde die postnatale Entwicklung der genannten endozytotischen Proteine mittels Immunfluoreszenzmikroskopie der Photorezeptorsynapsen in der äußeren plexiformen Schicht vergleichend zwischen Knockout und Kontrolle untersucht. Bereits ab dem postnatalen Tag 14 war eine verminderte Signalintensität in der mikroskopischen Analyse der endozytotischen Proteine Dynamin und Clathrin zu erkennen. Am postnatalen Tag 16 waren die Immunsignale für Dynamin in der OPL nahezu verschwunden. Für Clathrin ließ sich ebenfalls im Verlauf der drei untersuchten Tage ein deutlicher Abfall der entsprechenden Immunsignale erkennen. Aufgrund dieser Ergebnisse lässt sich die Hypothese bestätigen, dass CSPα nicht nur auf die Exozytose, sondern auch auf die Endozytose einen Einfluss hat. Die endozytotischen Proteine Clathrin und Dynamin zeigen sich durch einen CSPα-Knockout deutlich beeinträchtigt und könnten somit neben vielen anderen Proteinen, wie zum Beispiel dem SNAP-25, auch Substrate des CSPα sein.