Charakterisierung zweier neuer Antikörper gegen das synaptische Ribbonprotein Ribeye

Abstract

Unsere Augen verbinden die visuelle Umgebung mit dem Gehirn mittels spezialisierter chemischer Synapsen, die Ribbonsynapsen genannt werden. Ribbonsynapsen sind kontinuierlich aktive Synapsen, die eine tonische Transmitterfreisetzung auf einem hohen Niveau durchführen (Heidelberger et al., 2005; Schmitz, 2009; Lagnado und Schmitz, 2015). Für diese Aufgabe benötigen Ribbonsynapsen eine permanente Bereitstellung von aktivierten synaptischen Vesikeln, die dann ihren Neurotransmitterinhalt mittels Exozytose in den synaptischen Spalt freisetzen. Das synaptische Ribbon (deutsch: „synaptische Band“) ist die charakteristische, namensgebende Strukturspezialisierung der Ribbonsynapsen, welche an der aktiven Zone verankert ist (Sjostrand, 1953; Sterling et al., 2005). Dabei ist das synaptische Ribbon mit einer großen Anzahl von synaptischen Vesikeln assoziiert, die in der aktiven Zone für die kontinuierliche Exozytose zur Verfügung gestellt werden und ist zudem für die Organisation des synaptischen Vesikelzyklus sowie für die Aktivierung („Primen“) von synaptischen Vesikeln wichtig (Zenisek et al., 2000; Jackman et al., 2009; Joselevitch und Zenisek, 2020). Ribeye ist die Hauptkomponente des synaptischen Ribbons und findet sich in seiner spezifischen Zusammensetzung ausschließlich bei Ribbonsynapsen, wobei es essenziell für den Aufbau der synaptischen Ribbons ist (Schmitz et al., 2000; Maxeiner et al., 2016; Shankhwar et al., 2022). Das Protein Ribeye kann unterteilt werden in eine für Ribeye-spezifische aminoterminale A-Domäne, die primär strukturelle Aufgaben besitzt, und eine carboxyterminale B-Domäne, welche zu großen Teilen identisch mit CtBP2 ist, einem ubiquitär exprimierten Co-Repressor-Protein im Zellkern (Schmitz et al., 2000; Schmitz, 2009; Maxeiner et al., 2016). Während der letzten Jahre wurde Ribeye als Ziel für verschiedenste Interaktionen innerhalb des synaptischen Ribbons identifiziert und ist vermutlich der wichtigste Faktor, um die exakte Funktion der namensgebenden synaptischen Ribbons der Ribbonsynapsen zu verstehen (tom Dieck et al., 2005; Alpadi et al., 2008; Magupalli et al., 2008; Sheets et al., 2011; Schwarz und Schmitz, 2017; Müller et al., 2019). Ribbonsynapsen sind nicht nur in den Augen zu finden, sie sind ebenso wichtig fürs Hören und das Gleichgewicht. Deshalb sind Ribbonsynapsen ebenfalls in der Cochlea und dem Vestibularorgan zu finden, sie kommen aber ebenso in Photorezeptor-ähnlichen Zellen der Zirbeldrüse vor sowie im lateralen Seitenorgan und Elektrorezeptoren bei Fischen (Sterling et al., 2005; Moser, Brandt, et al., 2006; Nouvian et al., 2006; Matthews und Fuchs, 2010). Neben dem Hauptstrukturprotein Ribeye sind darüber hinaus noch weitere Proteine am synaptischen Ribbon zu erwarten, die spezifische Funktionen an der Oberfläche der Ribbons ausführen. Um diese und auch verwandte Fragen bezüglich der Molekularanatomie und funktionellen Rolle der Ribbons durch morphologische, biochemische und molekulare Techniken zu klären, sind Antikörper gegen Ribeye als funktionelle Werkzeuge von enormer Bedeutung. In meiner Dissertationsarbeit habe ich daher zwei neue monoklonale Antikörper, 10F8 und 13B5, gegen die B-Domäne von Ribeye analysiert und dabei die Funktionalität und Spezifität beider Antikörper für Ribeye durch verschiedene morphologische und biochemische Untersuchungen charakterisiert und belegt. Ich konnte zeigen, dass beide Antikörper Ribeye innerhalb der Augen von Mäusen und Rindern spezifisch erkennen, wobei starke und selektive Signale mit der Immunfluoreszenz-Technik gezeigt werden konnten. Für den Ribeye-Antikörper 10F8 konnte ich auch auf ultrastruktureller, elektronenmikroskopischer Ebene seine Bindung an die synaptischen Ribbons zeigen. Beide Antikörper zeigten im Western Blot die charakteristischen Ribeye-Banden. Die Spezifität der Antikörper für Ribeye wurde durch Untersuchungen an der Ribeye Knockout Maus ultimativ belegt. Um die Bindungsstelle weiter zu charakterisieren, habe ich Fusionsproteine der Untereinheiten der B-Domäne hergestellt. Beide Antikörper reagierten hierbei ausschließlich mit der sogenannten Substrat-bindenden (SBD)-Untereinheit der B-Domäne von Ribeye. Zur Bestimmung des exakten Epitops innerhalb SBD-Untereinheit der B-Domäne habe ich die Dot Blot-Methode mit überlappenden Peptidsequenzen benutzt und konnte dadurch die genaue Bindungsstelle der beiden Antikörper bestimmen. Diese Antikörper können nun eingesetzt werden, um eine mögliche Expression von Ribeye in den verschiedenen Regionen des ZNS im Detail zu untersuchen. Eine bereits ausgetestete mögliche Expression von Ribeye im Cerebellum konnte nicht verifiziert werden. Weiterhin können die neuen Antikörper von großer Bedeutung für die weitere biochemische Charakterisierung des synaptischen Ribbonkomplexes in Retina und Innenohr sowie der Zirbeldrüse sein.

CHARACTERIZATION OF TWO NEW ANTIBODIES AGAINST THE SYNAPTIC RIBBON PROTEIN RIBEYE Our eyes connect the visual environment to the brain using specialized chemical synapses called ribbon synapses. Ribbon synapses are continuously active synapses which perform tonical release of transmitters at high rates (Heidelberger et al., 2005; Schmitz, 2009; Lagnado and Schmitz, 2015). Therefore, ribbon synapses need a permanent supply of release-ready synaptic vesicles to perform continuous exocytosis. Exocytosis of synaptic vesicles and release of neurotransmitter occurs at the active zone. The synaptic ribbon is the unique characteristical structural specialization of ribbon synapses and is anchored to the active zone (Sjostrand, 1953; Sterling and Matthews, 2005). It is associated with a large number of synaptic vesicles that support continuous exocytosis at the active zone. The synaptic ribbon is also important for the organization of the synaptic vesicle cycle, including priming synaptic vesicles to provide release-ready vesicles (Zenisek et al., 2000; Jackman et al., 2009; Joselevitch and Zenisek, 2020). Ribeye is the main and essential component of the synaptic ribbon, a specific synapse protein only found at ribbon synapses (Schmitz et al., 2000; Maxeiner et al., 2016; Shankhwar et al., 2022). The Ribeye protein consists of an unique amino-terminal A-domain that mainly serves structural roles and a carboxyterminal B-domain that is largely similar to CtBP2, an ubiquitously nuclear co-repressor protein (Schmitz et al., 2000; Schmitz, 2009; Maxeiner et al., 2016). During the last years, Ribeye was identified as a target for many interactions inside the synaptic ribbon and is probably the most important factor to understand the accurate function of synaptic ribbons and ribbon synapses (tom Dieck et al., 2005; Alpadi et al., 2008; Magupalli et al., 2008; Sheets et al., 2011; Schwarz and Schmitz, 2017; Müller et al., 2019). Ribbon synapses are not exclusively found within the eye. They are also important for hearing and balance. Hence, ribbon synapses are located within the cochlea and vestibular organ. Ribbon synapses are also found in pineal photoreceptors, the lateral line system and electroreceptors in fish (Sterling et al., 2005; Moser, Brandt, et al., 2006; Nouvian et al., 2006; Matthews and Fuchs, 2010). Aside from Ribeye as the main structural component, other proteins are supposed to perform specialized functions at the surface of synaptic ribbons. Antibodies against Ribeye are important functional tools to answer this and other related questions concerning the molecular anatomy and functional role of ribbons using morphological, biochemical and molecular techniques. In my dissertation, I characterized two new mouse monoclonal antibodies against Ribeye, 10F8 and 13B5. I analyzed and proved the functionality and specificity of both antibodies using different morphological and biochemical methods. I demonstrated at the light microscopical level that both antibodies readily detect Ribeye/synaptic ribbons in the mouse and bovine retina. Both antibodies showed strong and selective signals by using immunofluorescence microscopy. For the monoclonal Ribeye antibody 10F8 I could also determine its binding at the ultrastructural electron microscopical level and demonstrated that it binds to the synaptic ribbon by post-embedding immunogold electron microscopy. In Western blot (WB) analyses, both antibodies detected the characteristic WB bands of Ribeye. Furthermore, experiments using Ribeye knockout mice ultimately proved the specificity of both antibodies for Ribeye. To further characterize the binding sites of the two novel Ribeye antibodies, I created fusion proteins encoding subunits of the B-domain of Ribeye. Both antibodies only bind to the so-called substrate-binding sub-domain (SBD) of the B-domain of Ribeye. To further map the exact epitope inside the B-domain that is detected by the antibodies I also performed dot blot analyses with overlapping peptides covering the B-domain of Ribeye and determined the precise binding sites. These new antibodies can now be used to further investigate various important questions in the field, including a possible expression of Ribeye in different areas of the CNS. A possible expression of Ribeye in the cerebellum could not be verified. Moreover, the new antibodies may have an utmost importance for the further biochemical characterization of the synaptic ribbon complex in the retina, inner ear and the pineal gland.