Development of enabling methodologies for drug metabolism studies in zebrafish larvae

Abstract

Drug metabolism studies are an integral part of the drug discovery and development process and preclinical testing. Likewise, drug metabolism is broadly investigated in clinical toxicology, particularly for screening purposes, since new emerging illicit drugs and drug-induced deaths are steadily increasing. More recently, zebrafish larvae became particularly popular as a non-animal in vivo model for predicting human metabolism. This work was dedicated to further refining zebrafish larvae models by applying and optimizing state-of-the-art technologies using three tool drugs. The direct administration of drugs using mi-croinjection was found to be beneficial compared to conventional waterborne exposure since the fast circulation of the drug inside the larval bodies, and in turn, indicated a high con-cordance with human metabolism. With morpholino oligonucleotides as an antisense gene-knockdown tool, the onset of drug metabolism related to liver function and cannabinoid receptor function was investigated to understand complex biological processes contributing to drug metabolism. Having established protocols, the in vivo distribution of drugs and their metabolites inside zebrafish larvae was visualized using mass spectrometry imaging (MSI). In conclusion, by establishing novel approaches and new methods in zebrafish larvae, the potential of the model for predicting human drug metabolism was consolidated, and this will contribute to its expansion into conventional ADMET studies.

Studien zum Arzneimittelstoffwechsel sind ein wesentlicher Bestandteil in der Entwicklung sowie in der präklinischen Testung neuer Arzneimittel. Da die Zahl neuer besorgniserregender illegaler Drogen und drogeninduzierte Todesfälle stetig zunehmen, wird der Arzneimittelmetabolismus ebenfalls in der klinischen Toxikologie, im Rahmen von Drogen-Screenings, umfassend untersucht. In jüngster Zeit haben sich Zebrafischlarven als ein beliebtes in vivo Testsystem für die Vorhersage des menschlichen Stoffwechsels erwiesen. Diese Arbeit widmet sich der weiteren Verfeinerung von Zebrafischlarvenmodellen durch Anwendung und Optimierung modernster Technologien. Die entwickelten Protokolle wurden mit Hilfe von drei Molekülen etabliert. Die direkte Verabreichung von Arzneistoffen mittels Mikroinjektion erwies sich als vorteilhaft im Vergleich zur herkömmlichen Verabreichung über das Wasser, da es eine schnelle Zirkulation des Arzneistoffs in den Larvenkörpern und damit einen effizienten Stoffwechsel ermöglicht, der eine hohe Übereinstimmung mit dem menschlichen Stoffwechsel aufweist. Mit Hilfe von Morpholino-Oligonukleotiden als Antisense-Gen-Knockdown-Tool wurde der Arzneimittelstoffwechsel im Zusammenhang mit der Leberfunktion und der Cannabinoidrezeptorfunktion untersucht, um die komplexen biologische Prozesse zu verstehen, die zum Metabolismus beitragen. Nach der Etablierung geeigneter Protokolle wurde die in vivo Verteilung von Arzneistoffen und ihren Metaboliten in Zebrafischlarven mithilfe von bildgebender Massenspektrometrie (MSI) visualisiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch die erfolgreiche Etablierung neuer Ansätze und neuer Methoden in Zebrafischlarven das Potenzial des Modells zur Vorhersage des menschlichen Arzneimittelstoffwechsels konsolidiert wurde, was zu seiner Ausweitung auf konventionelle ADMET-Studien beitragen wird.