Analyse des epithelialen Zellschicksals in Organoid- und 3D-Kulturen der menschlichen Cervix uteri im Kontext der Infektion durch humane Papillomviren

Abstract

Die Entstehung von Karzinomen der Cervix uteri ist in fast allen Fällen mit einer persistierenden Infektion durch Hochrisiko-Typen humaner Papillomviren verbunden. Zervikale Krebsvorstufen entspringen vorwiegend dem Bereich der Transformationszone, in deren Umfeld über metaplastische Prozesse das ursprünglich endozervikal vorliegende Säulenepithel graduell durch Plattenepithel ersetzt wird. Dabei ist der zelluläre Ursprung eines durch humane Papillomviren hervorgerufenen Zervixkarzinoms aufgrund des komplexen Epithelursprungs und der Umwandlungsprozesse umstritten. Um dieser Fragestellung experimentell nachgehen zu können, bedarf es einer Kombination von Kulturbedingungen, die zum einen ein möglichst unverändertes Wachstum der unterschiedlichen Zelltypen von Endo- und Exozervix entsprechend ihres epithelialen Ursprungs ermöglicht und zum anderen das Differenzierungspotenzial dieser Zellen ausschöpfen kann. Dazu wurden im Rahmen dieser Arbeit primäre Zellen aus dem Platten- und Säulenepithel der Cervix uteri isoliert und durch das Einbetten der Zellen in das Hydrogel Matrigel sowie der Kultivierung mit Induktoren und Inhibitoren verschiedener Signalwege, wie von Wingless-related integration site oder des Epidermalen Wachstumsfaktors, mittels Organoid-Zellkulturtechnik angezüchtet. Die so erzeugten Kulturen bildeten die Epithelien mit ihren zelltypspezifischen Markern entsprechend nach. Aus den uniform Säulenepithelmarker exprimierenden Zellen der endozervikalen Organoide entstanden durch Kultivierung auf einer dreidimensionalen organotypischen Kultur an der Luft-Medium-Grenze neben den Säulenepithelzellen außerdem de novo basal gelegene Zellen mit Plattenepithelmarkern entsprechend den in vivo vorhandenen Reservezellen. Wurden diese Zellen aus der organotypischen Kultur isoliert und in Matrigel unter den gleichen Bedingungen der Plattenepithel-Organoide kultiviert, bildeten sie Organoide mit dem charakteristischen Markerprofil des exozervikalen Plattenepithels aus. Endozervikale Organoide wiesen in Einzelzell-Sequenzierungen bereits eine mRNA-velocity für den Plattenepithelmarker p63 auf, was sich in einer fehlenden Expression reifer p63-mRNA bei gleichzeitigem Vorhandensein ungespleißter p63-RNA äußerte. Innerhalb von Immunfluoreszenz-Färbungen dieser endozervikalen Organoid-Kulturen konnte keinerlei nukleäre p63-Proteinexpression festgestellt werden. Durch Kultivierung endozervikaler Organoid-Zellen in organotypischen 3D-Kulturen und anschließend als Organoide kam es zu einer starken Induktion der p63-Proteinexpression, die über Immunfluoreszenz-Färbungen im Zellkern nachweisbar war. Die Kombination von Organoid- und organotypischer Kulturform beweist mit den Analysen der Einzelzell-Sequenzierung, im Hinblick auf die vorhandene mRNA-velocity in den endozervikalen Organoiden, und der nukleären Proteinexpression des Plattenepithelmarkers p63 in Zellen der endozervikalen organotypischen Kulturen und daraus gebildeten Organoiden das Transdifferenzierungspotenzial innerhalb des endozervikalen Säulenepithels zum charakteristischen Markerprofil des Plattenepithels. Zusätzlich konnten in dieser Arbeit Organoid-Zellen der Endo- sowie Exozervix erfolgreich mit HPV18 infiziert werden. Sie zeigten in 2D-, Organoid- und organotypischer Kultur die mRNA-Expression der viralen Gene E1^E4, E6, E7 und L1. Infizierte und uninfizierte Kulturen wurden außerdem bezüglich der Expression zellulärer inflammatorischer Faktoren untersucht. Durch Kombination der Organoid-Kultur und zweidimensionaler Kulturformen, sowohl mit als auch ohne Feeder-Zellen, konnte zudem die spontane Integration des viralen Genoms erreicht und studiert werden. Die Infektion von Organoiden zervikaler Epithelien mit HPV ermöglicht darüber hinaus die Untersuchung der Folgen einer HPV-Infektion in Abhängigkeit des zellulären Ursprungs der infizierten Zellen.

The development of carcinomas of the cervix uteri is in nearly all cases associated with persistent infection by high-risk types of human papillomaviruses. Cervical precancerous lesions originate predominantly in the region of the transformation zone, which describes the area in which the originally endocervical columnar epithelium is gradually replaced by squamous epithelium through metaplasia. The cellular origin of cervical carcinoma caused by human papillomaviruses is a debatable issue due to the complex epithelial origin and transformation processes. To be able to investigate this question experimentally, a combination of culture conditions is required which, on the one hand, allows a nearly unchanged growth of the different cell types of the endocervix and exocervix according to their epithelial origin and, on the other hand, can utilise the differentiation potential of these cells. For the purposes of this study, primary cells were isolated from the squamous and columnar epithelium of the cervix uteri and grown using the organoid cell culture technique by embedding the cells in the hydrogel Matrigel and culturing them with inducers and inhibitors of various signaling pathways such as Wingless-related integration site or Epidermal Growth Factor. These cultures recreate the epithelia according to their cell type-specific markers. When cells of endocervical organoids, uniformly expressing markers of columnar epithelium, were cultured on three-dimensional organotypic cultures at the air-medium interface, basally located cells with squamous epithelial character arose de novo, corresponding to the reserve cells present in vivo. When these cells were isolated from the organotypic culture and cultured in Matrigel under the same conditions of squamous organoids, they formed organoids with the characteristic marker profile of the exocervical squamous epithelium. Endocervical organoids already were found to have mRNA velocity for the squamous epithelial marker p63 in single-cell sequencing, as characterized by a lack of expression of mature p63 mRNA in the concurrent presence of unspliced p63 RNA. Within immunofluorescence staining no nuclear p63 protein expression was detected in endocervical organoid cultures. Cultivation of endocervical organoid cells in organotypic 3D cultures and subsequently as organoids resulted in a strong induction of p63 protein expression, which was detectable via immunofluorescence staining in the nucleus. The combination of organoid and organotypic culture conditions proves the transdifferentiation potential within the endocervical columnar epithelium to the characteristic marker profile of the squamous epithelium by single-cell sequencing analyses, in terms of mRNA velocity already present in the endocervical organoids, and nuclear protein expression of the squamous epithelial marker p63 in cells of endocervical organotypic cultures and organoids formed out of these. In addition, in this work, organoid cells of the endocervix as well as exocervix could be successfully infected with HPV18. They showed mRNA expression of viral genes E1^E4, E6, E7 and L1 in 2D, organoid and organotypic culture. Infected and uninfected cultures were additionally examined for expression of cellular inflammatory factors. By combining organoid cultures and two-dimensional culture conditions, with and without feeder cells, spontaneous integration of the viral genome was also achieved and studied. Furthermore, infection of organoids of cervical epithelia with HPV allows the investigation of the consequences of HPV infection depending on the cellular origin of the infected cells.