Application of the crystalline sponge method for metabolite structure elucidation

Abstract

The identification of metabolites during drug discovery and development can play a crucial role to understand their contribution to efficacy and safety. To investigate the metabolism of new drug candidates in human as early as possible, different in vitro systems from human origin are used. Standard structural elucidation tools like liquid chromatography-mass spectrometry, single-crystal X-ray diffraction or nuclear magnetic resonance spectroscopy are either limited in providing the complete structure of metabolites or require a larger amount of material not available from in vitro incubations. A new technology to overcome these limitations was introduced by Makoto Fujita in 2013 and is commonly known as the crystalline sponge method. The usage of a pre-existing crystal allows the complete crystallographic identification of small molecules at the atomic level by encapsulation of only nanogram amount of analyte material without the need for crystallization of the analyte itself. In this thesis, the structural elucidation of metabolites generated from in vitro incubations using the crystalline sponge method is described. First, the analysis of an active pharmaceutical ingredient and its known metabolites demonstrated, that the crystalline sponge technology is a valuable method to identify the complete structure of trace amounts of analytes isolated from incubation matrices. The crystallographic data provided the exact position of metabolism for phase I and phase II metabolites. The technology was further used to identify various known and unknown metabolites of the anthelmintic drug praziquantel, which has been used for treatment of the parasitic flatworm of the genus Schistosoma for several decades. Moreover, to optimize the soaking process of the crystalline sponge method, which is the key element of the technology, an affinity screening to prioritize the optimal soaking conditions for individual analytes without time-consuming X-ray diffraction measurements, was developed.

Die Identifizierung von Metaboliten während der Arzneimittelforschung und -entwicklung spielt eine wichtige Rolle um deren Beteiligung an der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit zu verstehen. Um den humanen Metabolismus von neuen Wirkstoffkandidaten so früh wie möglich zu untersuchen, werden verschiedene in vitro Systeme humanen Ursprungs verwendet. Konventionelle Strukturaufklärungsmethoden wie Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie, Einkristall-Röntgenstrukturanalyse oder Kernspinresonanzspektroskopie sind einerseits begrenzt in ihrem Informationsgehalt in Bezug auf die vollständige Metabolitenstruktur oder benötigen eine hohe Menge an Probenmaterial, welches durch in vitro Inkubationen nicht zur Verfügung steht. Eine Möglichkeit zur Überwindung dieser Einschränkungen wurde 2013 von Makoto Fujita vorgestellt und ist allgemein bekannt als Crystalline Sponge Methode. Die Verwendung eines bereits vorhandenen Kristalls erlaubt die kristallografische Bestimmung von kleinen Molekülen auf atomarer Ebene durch die Aufnahme von Nanogramm Mengen an Analytmaterial in das Kristallgitter und vermeidet dadurch die Notwendigkeit eines Einkristalls des Analyten. In der vorliegenden Dissertation wurde die Strukturaufklärung von Metaboliten aus in vitro Inkubationen unter Verwendung der Crystalline Sponge Methode beschrieben. Zunächst wurde anhand eines pharmazeutischen Wirkstoffes und seiner bekannten Metabolite veranschaulicht, dass die Crystalline Sponge Technologie eine nützliche Methode zur Bestimmung der vollständigen Struktur von geringen Mengen isolierter Analyten aus Inkubationsmatrizes darstellt. Die kristallografischen Daten bestimmten die exakte Position des Metabolismus für die vorliegenden Phase I und Phase II Metaboliten. Die Technologie wurde weiterhin zur Strukturaufklärung von bereits bekannten, sowie unbekannten Metaboliten des anthelmintischen Arzneistoffes Praziquantel verwendet, welcher seit vielen Jahrzehnten für die Behandlung des parasitären Plattwurms der Gattung Schistosoma eingesetzt wird. Um den entscheidenden Schritt der Crystalline Sponge Methode zu optimieren, wurde des Weiteren ein Affinitätsscreening zur Priorisierung der optimalen Methodenparameter für individuelle Analyten ohne Einsatz von zeitaufwendigen Röntgenkristallstrukturmessungen entwickelt.