In vitro Untersuchungen zu Proteinbiosynthese-assoziierten Prozessen : methylierungsabhängige Genregulation und Konkurrenz zwischen kanonischen und nicht-kanonischen Aminosäuren beim Einbau in Proteine

Abstract

Obwohl eine Vielzahl an Prozessen, die während der Proteinbiosynthese ablaufen, bereits ausführlich untersucht wurden, sind deren zugrunde liegende molekulare Mechanismen oft nicht vollständig verstanden. Prominente Beispiele sind methylierungsabhängige Genregulationsmechanismen sowie die Fehlerreduktion beim Einbau von Aminosäuren unter kompetitiven Bedingungen. Da zellfreie Expressionssysteme im Vergleich zu in vivo Systemen eine genauere Kontrolle diverser biochemischer Parameter erlauben, eignen sich solche Systeme für die Untersuchung der zuvor genannten Prozesse. Im Rahmen dieser Dissertation wurden unter Verwendung eines auf E. coli basierenden, zellfreien Expressionssystems zunächst zwei verschiedene methylierungsabhängige Genregulationsmechanismen untersucht: die MeCP2-assoziierte Genregulation sowie die Regulation des Pap epigenetischen Schalters. Bei beiden Untersuchungsobjekten ergaben sich Hinweise, dass eine veränderte Sekundärstruktur der DNA ein essenzieller Bestandteil der methylierungsabhängigen Genregulation ist. Das gleiche in vitro System wurde auch für Untersuchungen der Konkurrenz zwischen der kanonischen Aminosäure Lysin und deren nicht-kanonischem Analogon Hydroxylysin beim Einbau in Proteine verwendet. In diesem Zusammenhang wurden neue Methoden entwickelt, die den vollständigen seitenkettenspezifischen Einbau von Hydroxylysin als Lysin-Ersatz unter den bestehenden kompetitiven Bedingungen ermöglichten.

Although a variety of processes involved in protein biosynthesis are well examined, often there is a lack of knowledge regarding underlying molecular mechanisms. Prominent examples are methylation dependent gene regulation mechanisms, or the error reduction of amino acid incorporation in competitive situations. Because cell-free gene expression systems allow to control various biochemical parameters more precisely compared to in vivo systems, they are well suited for the investigation of the earlier mentioned processes. In this dissertation, at first, two different methylation dependent gene regulation mechanisms were investigated using an E. coli based, cell-free gene expression system: the MeCP2-associated gene regulation as well as the regulation of the pap epigenetic switch. Both objects of investigation agree well with the idea of an altered secondary structure of the DNA being an essential part of methylation dependent gene regulation. The same in vitro system was also used for the investigation of the concurrence between the canonical amino acid lysine and its noncanonical analog hydroxylysine during their incorporation into proteins. In this context, new methods were developed to achieve the complete residue-specific incorporation of hydroxylysine as a lysine surrogate under such competitive situations.