Influence of the strength of the initial cytotoxic synapse T cell receptor trigger on subsequent synapse formation and cytotoxic granule fusion

Abstract

For this thesis TIRF and SIM microscopy were used to visualize the behavior of CTLs on lipid bilayers that imitate a target cell by containing ICAM and biotinylated anti-CD3ᵋ antibodies. Differing concentrations of anti-CD3ᵋ antibody were used to study possible effects of varying TCR stimulus strengths on the modes of IS formation and CG fusion. Additionally, the localization of clathrin during IS formation was investigated. To address these scientific points, CTLs from C57BL/6 wildtype and/or Granzyme B mTFP knock-in mice were activated for 7 to 8 days and were made to overexpress various proteins of interest such as Syb2, clathrin, Rab11a or actin coupled to either pH-dependent or independent fluorophores depending on the pertaining question and imaged using high resolution fluorescence microscopy. We observed under our experimental conditions two different types of Syb2 pHuji behavior upon CG fusion that are seemingly stimulus independent. Interestingly, various stages of IS formation starting from the early actin clearance up to the fusion of CGs show different dependencies to the TCR stimulus. An optimum stimulus seems to be required for the stability and maximum CG fusion efficiency necessary for maximum effector function. Since endocytosis of Syb2 is a clathrin mediated process we investigated the localization of clathrin and interestingly observed three different localizations during different stages of IS formation. All together our data demonstrate the effects of varying TCR stimuli on specific stages of IS formation leading up to CG fusion.

When a cytotoxic T lymphocyte is activated by a target cell, it is forming a very close contact to this cell, called the immunological synapse [35]. As a result, cytotoxic granules are polarized towards the immunological synapse where they secret their cargo such as cytotoxic proteins like Granzyme B ultimately leading to the apoptosis of the target cell [20,80]. Different SNARE proteins are necessary for the exocytosis of a cytotoxic granule and Synaptobrevin 2 was shown to be part of the SNARE complex for that in murine cytotoxic T lymphocytes [67]. Additionally, proteins involved in this process are endocytosed [13] and depending on the strength of stimulus on the T cell receptor, different modes of endocytosis of Synaptobrevin 2 have been suspected. To address this scientific question cytotoxic T lymphocytes from Granzyme B mTFP knock-in mice were transfected with Synaptobrevin 2 pHuji, which is a pH-dependent fluorophore and would light up when the cargo of a cytotoxic granule would be secreted through an opening of the fusion pore. These cytotoxic T lymphocytes were analyzed on lipid bilayers containing ICAM protein at a concentration of (0.55 mg/ml) but three different concentrations of anti-CD3ᵋ antibody, to represent different stimulus strengths on the T cell receptor (5, 10 and 20 μg/ml). The result was that the Synaptobrevin 2 would either diffuse within three seconds into the plasma membrane after Granzyme B secretion, or it would stay at the same place of Granzyme B secretion and would be endocytosed within more than five minutes. These two event types occurred almost equally distributed among different concentrations of anti-CD3ᵋ antibody used as TCR triggers. However, the fusion efficiency and upon further investigation of the immunological synapse formation also the size and the stability of the immunological synapse turned out to be significantly different when the strength of stimulus at the T cell receptor is varied. This study suggests that there is an optimal strength of stimulus for immunological synapse formation and secretion of cytotoxic granules. In this study it was 10 μg/ml anti-CD3ᵋ antibody on lipid bilayer, because it triggers the lowest latency of cell adhesion to the lipid bilayer the highest secretion rate per cell, the largest size and the longest dwell time of CD3ᵋ TFP clusters and the highest stability of the dSMAC ring.

Wenn ein zytotoxischer T-Lymphozyt von einer Target-Zelle über dessen T-Zell-Rezeptor aktiviert wird, bildet sich eine immunologische Synapse aus [35]. Dies initiiert den Transport von zytotoxischen Vesikeln zu dieser Synapse und deren Inhalt wird sezerniert, wie zum Beispiel das zytotoxische Protein Granzyme B, welches zur Apoptose der Zielzelle führt [20,80]. Verschiedene SNARE Proteine sind am Sekretionsprozess eines zytotoxischen Vesikels beteiligt und es wurde nachgewiesen, dass Synaptobrevin 2 ein Teil des SNARE Komplexes in zytotoxischen T Lymphozyten der Maus ist [67]. Darüber hinaus, werden diese Proteine nach dem Prozess der Sekretion wieder in die Zelle aufgenommen [13] und es wird vermutet, dass es verschiedene Varianten gibt wie Synaptobrevin 2 wieder in das Zytoplasma der Zelle aufgenommen wird abhängig vom Stimulus am T-Zell-Rezeptor. Um diese Fragestellung zu beantworten wurden in dieser Studie Granzyme B mTFP knock-in zytotoxische T-Lymphozyten von der Maus mit dem Konstrukt Synaptobrevin 2 pHuji transfiziert. „pHuji“ ist ein Fluorophor das sensibel auf pH-Wert Erhöhungen (Deprotonierung) reagiert, daher leuchtet es hell auf, wenn das zytotoxische Vesikel seinen Inhalt durch die Fusionspore sezerniert, weil sich dann der pH-Wert von 6.1 auf 7.4 neutralisiert. Diese zytotoxischen T-Lymphozyten wurden auf einer künstlichen Doppellipidschicht mit derselben ICAM-1 Konzentration (0.55 mg/ml), aber mit drei verschieden anti-CD3ᵋ Antikörper Konzentrationen (5, 10 und 20 μg/ml), um verschieden hohe Stimuli am T-Zell-Rezeptor zu imitieren, mit dem TIRF-Mikroskop untersucht. Es stellte sich heraus, dass Synaptobrevin 2 pHuji entweder innerhalb von drei Sekunden nach der Granzyme B Sekretion lateral in die Plasmamembran diffundiert oder an derselben Stelle verbleibt nach der Sekretion und in mehr als fünf Minuten in das Zytoplasma aufgenommen wird, aber diese beiden Modi wurden gleich verteilt unabhängig von der anti-CD3ᵋ Antikörper Konzentration beobachtet. Die Sekretionseffizienz von zytotoxischen Vesikeln und durch genauere Untersuchung der Bildung der immunologischen Synapse, auch die Größe und die Stabilität der immunologischen Synapse waren zwischen den drei verschiedenen anti-CD3ᵋ Antikörper Konzentrationen signifikant unterschiedlich. Aufgrund dieser Ergebnisse, wird vorgeschlagen, dass es ein Stimulusoptimum am T-Zell Rezeptor gibt. In dieser Studie liegt es auf der künstlichen Doppellipidschicht bei 10 μg/ml anti-CD3ᵋ Antikörper, denn mit dieser Konzentration wurden die meisten zytotoxischen Vesikel sezerniert, die Latenzzeit zur Ausbildung einer immunologischen Synapse war am geringsten, die immunologische Synapse war am stabilsten und die größten und die am längsten verweilenden CD3ᵋ TFP Cluster wurden mit dieser Konzentration im cSMAC beobachtet.