Endocytosis of cytotoxic granules in mouse cytotoxic T-lymphocytes on lipid bilayers

Abstract

Cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) are a part of the adaptive immune system. CTLs fight infections by killing bacterially and virally infected target cells as well as tumor cells. They do so by forming a close contact with the infected cells; the contact zone is called immune synapse (IS). It is at the immune synaptic cleft that CTLs release their cytotoxic substances such as perforin and granzymes to kill the infected or tumor cells. Cytotoxic granules (CGs) contain cytotoxic substances and fuse at the IS to release the contents. The fusion of CGs (exocytosis) at the IS, a well-studied phenomenon, is a tightly regulated process. The reuptake of CG membrane components into the CTL after the release of its vesicular contents was shown to be essential for killing of multiple target cells (Chang et al., 2016). CTL-target cell conjugates were used in these confocal fluorescence imaging experiments. To study this process in more detail regarding spatial and temporal resolution, we used a previously established lipid bilayer system combined with total internal reflection (TIRF) microscopy. The CTLs were isolated from genetically modified synaptobrevin2-mRFP knock-in (Sybki) mice which allowed tracking of the endocytosis of CGs following their exocytosis via the mCherry fluorescence of synaptobrevin2. We used the CG membrane proteins synaptobrevin2 (Syb2) and Lysosomalassociated membrane protein 1 (LAMP1) as a functional readout of endocytosis. We found that Syb2 and LAMP1 both accumulate significantly at the IS following CG exocytosis, whereas Syb2 is exposed to the IS additionally in a CG independent manner after CTL degranulation. We were able to demonstrate that the endocytosis of Syb2 takes place both in a central and peripheral area of the IS. Our results further indicate that the central endocytic events of Syb2 happen within a hotspot, which is located close to the zone of CG exocytosis and at the central supramolecular activation cluster (cSMAC). Finally, the time range of Syb2 endocytosis indicates clathrin-mediated endocytosis as a possible mechanism of CG reuptake.

Zytotoxische T-Zellen (CTLs) sind Teil des adaptiven Immunsystem und verteidigen den Körper gegen bakteriell oder viral infizierte Körperzellen sowie Krebszellen. Dies tun sie, indem sie eine enge Kontaktzone mit ihrer Zielzelle bilden, die sogenannte immunologische Synapse (IS). Innerhalb dieser IS setzen die CTLs zytotoxische Substanzen wie Perforin oder Granzyme frei, um die infizierten oder entarteten Körperzellen abzutöten. Diese zytotoxischen Substanzen sind in zytotoxischen Granula (CGs) gespeichert, die mit der Zellmembran an der IS verschmelzen, um freigesetzt zu werden. Diese Verschmelzung mit der Zellmembran ist ein eng regulierter Prozess, welcher bereits gut erforscht ist. Chang et al. zeigten, dass die Wiederaufnahme der Membranbestandteile der CGs ein wichtiger Mechanismus der CTLs sind, um mehrere Zielzellen hintereinander abtöten zu können (Chang et al., 2016). Für ihre Studie nutzten sie CTL-Zielzellkonjugate und ein konfokales Fluoreszenzmikroskop. Um diesen Vorgang in größerer zeitlicher und räumlicher Auflösung zu untersuchen, benutzen wir die bereits etablierte Doppellipidschicht in Kombination mit total internal reflection (TIRF) Mikroskopie. Die CTLs wurden von genetisch veränderten synaptobrevin2-mRFP knock-in (Sybki) Mäusen gewonnen, deren CGs fluoreszenzmarkiert sind. Um der Endozytose der CGs nach deren Freisetzung zu folgen, entschieden wir uns, die Membranproteine Synaptobrevin2 (Syb2) und Lysosomalassociated membrane protein 1 (LAMP1) zu verwenden. Wir fanden heraus, dass sich Syb2 und LAMP1 nach der Exozytose der CGs signifikant an der immunologischen Synapse (IS) anreicherten, wobei Syb2 zusätzlich in einer von CGs unabhängigen Weise zur Membran der CTLs transportiert wird. Wir konnten zeigen, dass die Endozytose von Syb2 in der zentralen und peripheren Region der IS stattfindet. Weiterhin lassen unsere Ergebnisse den Schluss zu, dass die Endozytose von Syb2 in der zentralen Region der IS innerhalb eines Hotspots stattfindet, welcher nahe der Zone der CG Exozytose und im central supramolecular activation cluster (cSMAC) liegt. Schließlich liegt die Zeitspanne, in welcher die Endozytose von Syb2 abläuft, im Bereich der clathrin-vermittelten Endozytose, was diese als Mechanismus nahelegt.