Combined rAAV-based gene therapy and tissue engineering approaches to enhance the molecular mechanisms of articular cartilage repair

Abstract

Articular cartilage defects do not regenerate. Scaffold-assisted gene therapy is a highly promising novel approach for cartilage repair. Carbon dots, a class of carbon-dominated nanomaterials, are spherical carbonaceous nanomaterials of small sizes exhibiting water dispersibility, chemical stability, photoluminescence properties, and photostability. Here, the potential benefits of using carbon dots to deliver genes coding for the chondroreparative sex-determining region Y-type high-mobility group box 9 (SOX9) transcription factor and transforming growth factor beta (TGF-beta via the clinically adapted recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors were investigated as a means to stimulate chondrogenic processes in human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (hMSCs) versus control (reporter rAAV-lacZ vector) application. hMSCs naturally repopulate cartilage defects but tend to lose their chondrogenic potential over time. Carbon dot-guided genetic modification of hMSCs may rejuvenate these cells in the defects either upon administration of carbon dot/rAAV composites in vivo or by implantation of hMSCs genetically modified by the composites. Four carbon dots were tested to identify an optimal compound (CD-1: citric acid, pentaethylenehexamine; CD-2: citric acid, poly(ethylene glycol) (PEG) monomethyl ether MW 550 Da, N,N-dimethylethylenediamine; CD-3: citric acid, branched poly(ethylenimine) MW 600 Da, PEG monomethyl ether MW 2 kDa; CD-4: citric acid, branched poly(ethylenimine) MW 600 Da). All were capable of formulating and releasing rAAV-lacZ for an effective modification of hMSCs. Among them, CD-2 was optimal to effectively and safely deliver rAAV for at least 10 days, the longest time point examined. Administration of therapeutic (SOX9, TGF-beta) rAAV vectors via CD-2 led to an effective overexpression of these genes in hMSCs, enhancing cell proliferation (TGF-beta) and matrix deposition (glycosaminoglycans, type-II collagen) (SOX9, TGF-beta) for at least 21 days relative to control treatments (CD-2 formulating rAAV-lacZ or lacking rAAV), while restricting undesirable type-I and -X collagen deposition (SOX9, TGF-beta). These results show the potential of carbon dot-guided rAAV modification of hMSCs as a minimally invasive system for translational strategies aiming at enhancing cartilage repair.

Defekte des hyalinen Gelenkknorpels regenerieren nicht. Die gerüstgestützte Gentherapie ist ein vielversprechender neuer Ansatz für die Knorpelreparatur. Carbon-Dots (Kohlenstoff-Punkte), eine Klasse kohlenstoffdominierter Nanomaterialien, sind kugelförmige kohlenstoffhaltige Nanomaterialien kleiner Größe, die Wasserdispergierbarkeit, chemische Stabilität, Photolumineszenz sowie und Photostabilität aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden die potenziellen Vorteile der Verwendung von Carbon-Dots zur Bereitstellung von Genvektoren auf Basis der klinisch-adaptiven rekombinanten adeno-assoziierten viralen (rAAV) Vektoren für den chondrogenen Transkriptionsfaktor SOX9 (geschlechtsbestimmende Region Y-Typ-Hochmobilität-sgruppenbox 9) und den transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-) zur Stimulierung chondrogener Prozesse in aus humanem Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) im Vergleich zur Kontrollanwendung (Reporter-rAAV-lacZ-Vektor) untersucht. Obwohl hMSCs auf natürliche Weise Knorpeldefekte besiedeln, neigen sie dazu, ihr chondrogenes Potenzial im Laufe der Zeit zu verlieren. Eine durch Carbon-Dots gesteuerte genetische Modifikation von hMSCs kann diese Zellen in den Defekten entweder durch die Verabreichung von Carbon-Dots/rAAV-Kompositen in vivo oder durch Implantation von durch diese Komposite genetisch modifizierter hMSCs phänotypisch modulieren. Vier Arten von Carbon-Dots wurden analysiert, um eine optimale Verbindung zu identifizieren [CD-1: Zitronensäure, Pentaethylenhexamin; CD-2: Zitronensäure, Polyethylenglykolmonomethylether (Molekülmasse M = 550 Da), N, N-Dimethylethylendiamin; CD-3: Zitronensäure, verzweigtes Polyethylenimin, (M = 600 Da), Polyethylenglykolmonomethylether (M = 2000 Da); CD-4: Zitronensäure, verzweigtes Polyethylenimin (M = 600 Da)]. Alle Komponenten waren in der Lage, rAAV-lacZ für eine wirksame genetische Modifikation von hMSCs zu formulieren und freizusetzen. Unter diesen war CD-2 optimal, um rAAV für mindestens 10 Tage, den längsten untersuchten Zeitpunkt, effektiv und sicher freizusetzen. Die CD-2-vermittelte 7 Verabreichung der therapeutischen SOX9- oder TGF--rAAV-Vektoren führte zu einer wirksamen Überexpression dieser Gene in hMSCs, wodurch die Zellproliferation (TGF-) und die Matrixdeposition (Glykosaminoglykane, Typ-II-Kollagen) (jeweils nach SOX9 und TGF--Therapie) für mindestens 21 Tage im Vergleich zu Kontrollbehandlungen (CD-2, ohne oder mit rAAV-lacZ formuliert) verstärkt wurde, während eine unerwünschte Typ-I- und Typ-X-Kollagenproduktion jeweils nach SOX9 und TGF--Therapie reduziert ist. Diese Ergebnisse zeigen das Potenzial einer durch Carbon-Dots gesteuerten rAAV-Modifikation von hMSCs als minimalinvasives System für translationale Strategien zur Verbesserung der klinischen Knorpelreparatur.