Der Sec61-Komplex des Endoplasmatischen Retikulums: Proteintargetingrouten und pathogene Mechanismen

Abstract

The Sec61 complex represents a multifunctional protein unit in the membrane of the endoplasmic reticulum, which is composed of three subunits. The Sec61α protein is the largest and central subunit of this complex. It forms an aqueous pore in the membrane, allowing active transport of newly synthesized proteins into the ER and simultaneously the passive calcium flux out of the ER. Both of these functions are crucial for cell viability. Therefore, the aims of this study were: (A) To identify the components of the SND protein targeting pathway, which guides proteins to the Sec61 complex. These components are unknown in the human system except for the hSnd2 protein. (B) To identify, characterize and modulate the pathological effects triggered by autosomal dominant tubulointerstital kidney disease (ADTKD)-associated SEC61A1 mutations at the molecular level using a cellular disease model. Based on Co-IP experiments performed with the hSnd2 protein the ER membrane protein TMEM109 was identified as hSnd3 candidate. The co-localization and direct protein-protein-interaction of these two proteins was confirmed in living cells. Simultaneously, previously published in vitro interaction data regarding hSnd2 were confirmed and expanded, as both proteins are in the vicinity of Sec61α and further translocon components (Fig. 1A). The ADTKD associated SEC61A1 mutations V67G (plug domain) and T185A (near to pore ring) are located near to specific functional domains of this protein. Both mutations result in negative protein transport effects, with stronger effects in V67G as in the T185A mutant. A substrate specific transport limitation was revealed. These suggested that the reason of the transport restriction could be determined by the composition of the signal sequence. live-cell calcium imaging experiments demonstrated that both mutants had a reduced calcium pool in the ER. The T185A variant showed in contrast to the V67G mutant a reduced Sec61α-mediated calcium leak from the ER. The reduced amount of total calcium may be related to the observed diminished protein abundances for calcium regulatory proteins. (Fig. 1B). To correct the malfunctions in the cell culture model the chemical chaperone 4-PBA was used. This drug mitigated the negative effects on protein transport and calcium homeostasis in the mutant cells to the level of the untreated wild type. Ultimately, my findings provide new insights in understanding protein trafficking of newly synthesized proteins to and into the ER and the Sec61α dependent calcium regulation.

Der Sec61-Komplex stellt eine multifunktionale Proteineinheit in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums dar, welcher aus drei Untereinheiten zusammengesetzt ist. Die größte und zentrale Untereinheit ist das Protein Sec61α, welches eine wässrige Pore in der Membran bildet und so den aktiven Transport von neu synthetisierten Proteinen in das ER reguliert und den simultanen passiven Calciumstrom aus dem ER heraus erlaubt. Beide Funktionen spielen eine entscheidende Rolle für die Vitalität der Zelle. Daher war es das Ziel dieser Arbeit: (A) Komponenten des SND-Proteintargetingweges zum Sec61-Komplex zu identifizieren, für den im humanen System nur hSnd2 bekannt ist. (B) die pathologischen Effekte, die durch autosomal dominant tubulointerstital kidney disease (ADTKD) assoziierte SEC61A1-Mutationen ausgelöst werden, auf molekularbiologischer Ebene anhand eines Zellkulturmodells der Krankheit zu definieren und zu modulieren. Auf der Basis von Co-IP Experimenten, die mit dem hSnd2-Protein durchgeführt wurden, ist TMEM109-Protein durch dessen Interaktion als hSnd3-Kandidat identifiziert worden. Die gemeinsame Lokalisation und direkte Interaktion dieser beiden Membranproteine des ER wurde in lebenden Zellen verifiziert. Gleichzeitig wurden bereits publizierte in vitro Interaktionsstudien für hSnd2 bestätigt und erweitert, da beide Proteine eine räumliche Nähe zum Sec61α-Protein und dem Translokon zugehörigen Komponenten aufwiesen (Abb. 1A). Die ADTKD assoziierten SEC61A1-Mutationen V67G und T185A liegen in (V67Gplug Domäne) oder nahe an (T185A pore ring) funktionell wichtigen Domänen des Sec61α-Proteins. Aus beiden Mutationen resultierten negative Proteintransporteffekte, von welchen die V67G-Mutante stärker betroffen war als die T185A-Mutante. Hierbei zeigten sich substratspezifische Einschränkungen des Proteintransportes. Diese ließen vermuten, dass die Grundlage der Transporteinschränkung in der Zusammensetzung der Signalsequenz zu finden sein könnte. live-cell calcium imaging Experimente belegten, dass beide Mutanten einen verringerten Calciumpool im ER aufwiesen. Hier zeigte sich in der T185A-Variante ein ebenfalls reduzierter Sec61α-vermittelter Calciumleak aus dem ER. Die reduzierte Menge des Gesamtcalciums der Zellen könnte in Verbindung mit den reduzierten Proteinabundanzen für calciumregulatorische Proteine stehen. Milderung dieser Fehlfunktionen auf Zellkulturebene erfolgte durch das chemische Chaperon 4-PBA. Durch dessen Einsatz konnte der negativ beeinflusste Proteintransport und die fehlregulierte Calciumhomöostase in den mutierten Zellen wieder an das Niveau des unbehandelten Wildtyps angepasst werden (Abb. 1B). Zusammengenommen liefern die generierten Ergebnisse ein vertieftes Verständnis des Proteintransportes neu synthetisierter Proteine zum und in das ER sowie die Sec61α-abhängige Calciumregulation.