Untersuchung der DNA-Reparaturkapazität strahleninduzierter DNA-Doppelstrangbrüche in Blut-Lymphozyten von Kindern mit malignen Erkrankungen

Abstract

Fragestellung: Als Ursachen maligner Tumore bei Kindern spielen steigendes Lebensalter und Exposition gegenüber mutagener Noxen eine untergeordnete Rolle. Genetische Veränderungen der Erbsubstanz erscheinen als Auslöser wahrscheinlicher. Eine verminderte oder fehlerhafte Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) der Desoxyribonukleinsäure (DNA) kann, wie Studien bereits gezeigt haben, zu einer erhöhten Tumorwahrscheinlichkeit führen. DNA-Reparaturproteine, die im Umfeld eines DSBs akkumulieren, können bei der Immunfluoreszenzmikroskopie (IFM) mittels Antikörper-basierter Markierung als punktförmige Lichtsignale, sogenannte Foci, lichtmikroskopisch in den Zellkernen der Lymphozyten visualisiert werden. Ziel war es durch die quantitative Analyse vorhandener Foci an definierten Zeitpunkten nach der Bestrahlung Patienten mit eingeschränkter DNA-Reparaturkapazität zu identifizieren. Material und Methoden: Lymphozyten wurden aus dem Blut von Kindern mit Malignomen (n = 24) sowie aus gesunden Kontrollkindern (n = 18) isoliert und kryokonserviert. Nach späterer Kultivierung der Lymphozyten wurden diese ex vivo bestrahlt, drei unterschiedliche DNA-Reparaturfaktoren (γH2AX-, pATM- und 53BP1) markiert und zu definierten Zeitpunkten (30 Minuten, 8 und 24 Stunden) nach Bestrahlung die Foci quantitativ erfasst. Im Laufe des Projektes waren Proben (n = 16) wegen der geringen Anzahl an sedimentierten Zellen aufgrund kleiner Blutvolumina und Zellverlust während der IFM-Markierung nicht auswertbar. Auf Basis einer Literaturrecherche wurde die Methode zum Aufbringen der Zellen auf die Objektträger modifiziert. Hierdurch war es möglich eine ausreichende Menge an Lymphozyten mittels IFM zu analysieren (Malignome n = 14; Kontrollen n = 12). Darüber hinaus wurde der Therapieverlauf der Kinder mit Malignom anhand deren Akten über 6 Jahre ausgewertet um mögliche Parallelen zwischen ausgeprägten Tumortherapie-assoziierten Nebenwirkungen und einer eventuell vorhandenen verminderten DNA-Reparaturkapazität zu detektieren. Ergebnisse: Durch den Vergleich quantifizierter γH2AX, pATM und 53BP1-Foci konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Kindern mit Malignomen und gesunden Kindern nachgewiesen werden. Schlussfolgerung: Die Hypothese, dass eine verminderte DNA-Reparaturkapazität eine mögliche Ursache für die Entstehung maligner Erkrankungen im Kindesalter darstellt, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Einflussfaktoren wie die Kryokonservierung der Lymphozyten, die maschinelle Zellzentrifugation als Sedimentationsverfahren, die kleine Fallzahl oder der Studieneinschluss von Leukämiepatienten könnten dazu geführt haben, dass eine verminderte DSB-Reparaturkapazität nicht mehr detektierbar war. Zur Validierung des Ergebnisses sollten die Experimente an Lymphozyten ohne vorangegangener Kryokonservierung und einer deutlich höheren Anzahl an Patienten erneut erfolgen.

Purpose: As the causes of malignant tumors in children, increasing age and exposure to mutagenic noxae play a subordinate role. Genetic changes in the genetic material appear to be a more likely trigger. A reduced or faulty repair of double-strand breaks (DSBs) in deoxyribonucleic acid (DNA) can, as studies have already shown, lead to an increased likelihood of tumors. DNA repair proteins that accumulate in the vicinity of a DSB can be visualized in the cell nuclei of the lymphocytes as punctiform light signals, so-called foci, using antibody-based marking in immunofluorescence microscopy (IFM). The aim was to identify patients with limited DNA repair capacity through the quantitative analysis of existing foci at defined times after irradiation. Material and Methods: Lymphocytes were isolated from the blood of children with malignancies (n = 24) and from healthy control children (n = 18) and cryopreserved. After later cultivation of the lymphocytes, they were irradiated ex vivo, three different DNA repair factors (γH2AX-, pATM- and 53BP1) were marked and the foci were quantitatively recorded at defined times (30 minutes, 8 and 24 hours) after irradiation. In the course of the project, samples (n = 16) could not be evaluated due to the small number of sedimented cells, due to small blood volumes and cell loss during IFM labeling. On the basis of a literature search, the method for applying the cells to the slide was modified. This made it possible to analyze a sufficient amount of lymphocytes using IFM (malignancies n = 14; controls n = 12). In addition, the course of therapy of the children with malignancy was evaluated on the basis of their files over a period of 6 years in order to detect possible parallels between pronounced tumor therapy-associated side effects and a possibly existing reduced DNA repair capacity. Results: By comparing quantified γH2AX, pATM and 53BP1 foci, no significant difference between children with malignancies and healthy children could be demonstrated. Conclusion: The hypothesis that a reduced DNA repair capacity is a possible cause for the development of malignant diseases in childhood could not be confirmed in this study. Influencing factors such as the cryopreservation of the lymphocytes, machine cell centrifugation as a sedimentation method, the small number of cases or the study inclusion of leukemia patients could have led to a reduced DSB repair capacity no longer being detectable. To validate the result, the experiments on lymphocytes without prior cryopreservation and a significantly higher number of patients should be carried out again.