Charakterisierung PEX19-abhängiger Effekte auf die Ca2+-Homöostase in HeLa-Zellen

Abstract

Während Lipidtröpfchen (LT) lange Zeit für inerte Organellen zur Speicherung von metabolischer Energie in Form von Neutrallipiden gehalten wurden, ist mittlerweile deutlich geworden, dass es sich um hoch dynamische Organellen mit einer Vielzahl von physiologischen Funktionen handelt. Diese umfassen neben der Speicherung von Neutrallipiden auch die kontrollierte Freisetzung von Fettsäuren, den Schutz der Zellen vor Lipotoxie und die Speicherung von Cholesterolestern. In den Fokus der Forschung gelangten LT auch wegen ihrer Assoziation mit einer Vielzahl von häufigen Erkrankungen, so sind Akkumulationen von LT mit Erkrankungen wie Adipositas, Typ-2-Diabetes und Atherosklerose assoziiert. Von Schrul und Kopito wurde vor kurzem ein SRP (Signalerkennungspartikel)-unabhängiger Lokalisationsweg zur Integration des Haarnadel-Proteins UBXD8 und vermutlich auch weiterer LT-Proteine ins endoplasmatische Retikulum (ER) entdeckt, welcher auf einer farnesylierten Form von PEX19 beruht. Erste Experimente deuteten auf eine verlangsamte Lipolyse in Zellen in Abwesenheit von wildtypischem PEX19 hin. Die vollständige Regulation der Lipolyse ist noch unverstanden, aber es konnte ein Zusammenhang zwischen einer veränderten Ca2+-Homöostase und einer gestörten LT-Biogenese, einhergehend mit einer veränderten Lipolyse, aufgezeigt werden. Ziel der Arbeit war es zu untersuchen, ob PEX19-vermittelte Funktionen Auswirkungen auf die Ca2+-Homöostase haben. Dazu sollten Fura-2-AM basierte Experimente zur Untersuchung der gesamtzellulären Ca2+-Konzentration, des ER-Ca2+-Lecks, des SOCE (Store-operated Ca2+ entry) sowie der Nicht-ER-Ca2+-Speicher erfolgen. Organell-spezifische Messungen sollten die mitochondriale Ca2+-Homöostase näher beleuchten. Zudem sollten Immunoblots Aufschluss über eine mögliche veränderte Abundanz Ca2+-kontrollierender Transporter und Kanäle geben. In dieser Arbeit wurde eine HeLa PEX19 knockout Zelllinie (PEX19-/-) sowie eine HeLa PEX19-/-PEX19C296S-Zelllinie, welche ausschließlich eine farnesylierungsdefiziente Form von PEX19 exprimiert, im Vergleich zu Wildtyp HeLa-Zellen untersucht. Die PEX19-/--Zelllinie weist eine vollständige Deletion der Peroxisomen sowie ein verändertes LT-Proteom auf, wohingegen die PEX19-/-PEX19C296S-Zelllinie zwar Peroxisomen besitzt, aber auch ein verändertes LT-Proteom aufweist. Mithilfe dieser Zelllinien ist eine Differenzierung zwischen Effekten fehlender Peroxisomen und eines veränderten LT-Proteoms möglich. In Fura-2-AM basierten Experimenten zeichneten sich niedrigere ER-Ca2+-Konzentration, ein veränderter Verlauf der zytosolischen Ca2+-Konzentration nach Induktion des SOCE sowie veränderte Nicht-ER-Ca2+-Speicher in Abwesenheit von wildtypischem PEX19 ab, die nicht auf das Fehlen von Peroxisomen zurückzuführen waren. Die mitochondrialen Ca2+-Messungen mittels Organell-spezifischer Reporterproteine wiesen auf erhöhte mitochondriale Ca2+-Konzentrationen hin, ließen sich jedoch nicht eindeutig einem peroxisomalen oder LT-Proteom Phänotyp zuordnen. Bei einem Teil der untersuchten in die Ca2+-Homöostase involvierten Transporter und Kanäle, insbesondere SERCA, PMCA, MCU und VDAC sowie Atmungskettenproteinen zur mitochondrialen Charakterisierung, war eine deutliche Reduktion der Abundanz ermittelbar. Damit ließen sich in der vorliegenden Arbeit erstmals PEX19-abhängige Veränderungen der Ca2+-Homöostase nachweisen, die mit der beobachteten verminderten Lipolyse korrelieren. Inwieweit die gestörte Ca2+-Homöostase dabei Ursache oder Folge der eingeschränkten Lipolyse ist lässt sich nicht abschließend klären. Allerdings deuten die Ergebnisse auf eine mögliche Störung des Energiehaushaltes in Abwesenheit von wildtypischem PEX19 hin, die ursächlich für die gestörte Ca2+-Homöostase und die möglicherweise daraus resultierende eingeschränkte Lipolyse verantwortlich sein könnte.

While lipid droplets (LDs) have been long considered as inert organelles for the storage of fatty acids in the form of neutral lipids, by now it became clear that they are highly dynamic organelles with a variety of physiological functions. Besides the storage of neutral lipids these also include the controlled release of fatty acids, the protection of the cell against lipotoxicity and the storage of cholesterol esters. Also due to their involvement in a multitude of frequent diseases they got into focus of research as accumulation of LDs has been associated with diseases such as adipositas, diabetes type 2 and atherosclerosis. Recently Schrul and Kopito discovered an SRP (signal recognition particle)-independent localisation pathway for the integration of the hairpin protein UBXD8 and probably also further LD proteins into the endoplasmic reticulum (ER) that depends on a farnesylated form of PEX19. Preliminary experiments suggest a defect in lipolysis in absence of wild type PEX19. The complete regulation of lipolysis is not yet understood but a connection between an altered Ca2+ homeostasis and a disturbed biogenesis of LDs accompanied by an altered lipolysis has been shown. The aim of this thesis was to investigate if PEX19-mediated functions have effects on cellular Ca2+ homeostasis. Therefore Fura-2-AM based experiments should be performed to determine the whole cell Ca2+ concentration, the ER Ca2+ leak, SOCE (store-operated Ca2+ entry) as well as non-ER Ca2+ storage. In addition, organelle specific measurements should be performed to elucidate the mitochondrial Ca2+ storage. Moreover immunoblot-based experiments should reveal potentially altered abundances of Ca2+ controlled transporters and channels. In order to differentiate between effects derived from the absence of peroxisomes and an altered LD proteome different cell lines were investigated: a HeLa PEX19 knockout cell line (PEX19-/-) and a HeLa PEX19-/-PEX19C296S cell line exclusively expressing a farnesylation-deficient form of PEX19 were analysed together with wild type HeLa cells for comparison. The PEX19-/- cell line shows a complete loss of peroxisomes next to an altered LD proteom whereas the PEX19-/-PEX19C296S cell line has peroxisomes but is also characterised by an altered LT proteom. By means of these cell lines it is possible to differentiate between effects of absent peroxisomes and an altered LD proteom. The Fura-2-AM based experiments revealed a lower ER Ca2+ concentration, a varied course of the cytosolic Ca2+ concentration after SOCE induction as well as an altered non-ER Ca2+ storage in absence of wild type PEX19, which could not be attributed to the loss of peroxisomes. The mitochondrial Ca2+ measurements indicated elevated mitochondrial Ca2+ concentrations. However, they could not be clearly assigned to a peroxisomal or LD proteom phenotype. Some of the analysed transporters and channels involved in the Ca2+ homeostasis, especially SERCA, PMCA, MCU and VDAC as well as respiratory chain proteins for mitochondrial characterisation showed a significant decrease in protein abundance. Thus, in this work PEX19-dependent effects on Ca2+ homeostasis could be determined for the first time. The results may indicate a disturbance in cellular energy balance in the absence of PEX19, which could be the cause for the disturbed Ca2+ homeostasis and potentially also for a reduction in lipolysis.