Elucidating the role of histone variant H2A.J following ionizing radiation

Abstract

Senescence is a stress-induced state in which cells cease proliferation whilst remaining metabolically active. While it is a noteworthy tumour suppressor mechanism, accumulation of senescent cells in aged or DNA-damaged tissue through toxins such as ionizing radiation (IR), has been implicated as a one of the nine hallmark ageing mechanisms as well as inducing premature ageing and promoting neoplastic growth. The limited study of novel histone variant H2A.J, has uncovered targeted accumulation of H2A.J in etoposide (ETO)-induced and oncogene-induced senescence (OIS). Additionally, it plays a functional role in induction of the inflammatory senescence-associated secretory phenotype, a major effector of ageing and cancer. Whilst the DNA-damaging properties of radiotherapy aid in tumour growth control, healthy tissue is inevitably exposed to low doses of irradiation with side-effects including inflammation and radiation–induced senescence. This study therefore seeks to elucidate a possible role of H2A.J association with irradiation-induced senescence, DNA-damage repair and senescence-associated secretory phenotype.

H2A.J knock-down WI-38 lung fibroblasts and No-Target WI-38 lung fibroblasts containing unaltered H2A.J expression were irradiated and compared. Immunofluorescence microscopy (IFM) examinations were applied to determine normal H2A.J accumulation in response to IR, DNA-damage repair efficiency, senescence induction, proliferative arrest, senescence-associated heterochromatin foci (SAHF) formation and DNA-segments with chromatin alterations reinforcing senescence (DNA-SCARS) formation. Transmission electron microscopy (TEM) was applied to gain further insight into senescence-associated chromatin changes and H2A.J localisation in respect to SAHF and DNA-SCARS. Furthermore, ultrastructure of DNA-SCARS was examined at the nanoscale using TEM. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) following irradiation was investigated using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) performed on conditioned medium and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) on isolated RNA. Additionally, aged- and ex-vivo irradiated human epidermis was evaluated for DNA-damage foci and H2A.J accumulation using IFM. In vivo immunofluorescence microscopy examinations of 20x 0.1Gy irradiated murine epidermis was also completed to gain insight into the long term accumulation of H2A.J following low-dose fractionated irradiation.

In vitro studies revealed H2A.J accumulates in a dose-dependent manner with lower doses resulting in transient accumulation and higher doses inducing senescence leading to long-term H2A.J positivity. H2A.J did not influence repair capacity following IR. Knock-down of H2A.J did not affect senescence induction, proliferative arrest, and SAHF formation. It did however, effect ultrastructure of DNA-SCARS thus potentially explaining the altered SASP revealed by ELISA and RT-qPCR. Human epidermal biopsy examinations revealed increased H2A.J in aged epidermis together with increasing presence of DNA-damage foci. In vivo murine epidermis showed increased H2A.J accumulation up to 6 months post-IR at a level similar to 18 month old aged mice.

This work provides a baseline insight into H2A.J accumulation following IR revealing potential insight into its influence on IR-induced SASP regulation. Additionally, indications arose for the application of H2A.J as a potential biomarker of senescent cells in culture, as well as, in human epidermal biopsies.

Die Bedeutung der Histonvariants H2A.J nach ionisierender Strahlung

Seneszenz beschreibt einen durch Stress induzierten zellulären Zustand, indem keine Proliferation stattfindet, die Zelle aber trotz allem metabolisch aktiv bleibt. Während Seneszenz damit in erster Linie einen effizienten Tumorsuppressions-Mechanismus darstellt, unterstützt die Akkumulation seneszenter Zellen in gealtertem oder bestrahltem Gewebe frühzeitige Alterung und das Tumorwachstum. Eine aktuelle Studie der Histonvariante H2A.J zeigt die Akkumulation von H2A.J im Rahmen einer Etoposid- und Onkogen-induzierten Seneszenz. Weiterhin bestätigte sich ein Zusammenhang zwischen H2A.J und der Induktion des Seneszenz-assoziiertem sekretorischem Phänotyps (SASP), einem Haupteffektor von Alterung und Krebs. In der Radiotherapie macht man sich die DNA-schädigenden Eigenschaften von ionisierender Strahlung zur gezielten Kontrolle des Tumorwachstums zu Nutze, wobei auch gesundes Gewebe in Tumornähe mit niedrigen Strahlendosen belastet wird. Dies kann möglicherweise Nebenwirkungen, wie Inflammation und strahlen induzierte Seneszenz, zur Folge haben. Im Rahmen dieser Dissertation sollen mögliche Zusammenhänge zwischen H2A.J und strahlen induzierter Seneszenz, der DNA-Schadensantwort sowie dem SASP untersucht werden. Mithilfe von WI-38 Lungenfibroblasten, die zum einen eine unveränderte Expression von H2A.J durch Einbringung einer „No-Target“-Leerkassette und zum anderen einen H2A.J Knock-down aufweisen, wurden Unterschiede nach Bestrahlung eruiert. Unter Anwendung immunfluoreszenzmikroskopischer Analysen wurde die Akkumulation von H2A.J, die Effizienz der DNA-Reparatur, die Proliferation, die Seneszenz-assoziierten heterochromatischen Foci (SAHF) und die Entstehung von DNA- Segments with chromatin alterations reinforcing senescence (DNA-SCARS) untersucht. Anhand des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) wurden zudem weitere Einblicke in die Lokalisation von H2A.J im Kontext von SAHF und DNA-SCARS gewährt. Zusätzlich wurde mittels TEM die Ultrastruktur und Entstehung von DNA-SCARS bestimmt. Der strahleninduzierte SASP wurde mithilfe eines ELISA im Zellüberstand gemessen und die Expression, der involvierten Gene, an Hand von RT-qPCR analysiert. Weiterhin wurden durch IFM-Analysen DNA-Reparaturfoci und die H2A.J Akkumulation in gealterter und ex-vivo bestrahlter humaner Epidermis bestimmt. Abschließend wurde die Langzeit-Akkumulation von H2A.J in niedrig-dosis-exponierter muriner Epidermis untersucht. In vitro Untersuchungen ergaben eine dosisabhängige Akkumulation von H2A.J nach Bestrahlung mit einer vorübergehenden H2A.J-Zunahme nach niedrigen Dosen und einer induzierten Seneszenz mit bleibender H2A.J-Expression nach hohen Dosen. Es zeigte sich zudem, dass die Effizienz der DNA-Schadensreparatur nach Bestrahlung nicht durch H2A.J beeinflusst wurde und dass der Knock-down von H2A.J keine Auswirkung auf die Seneszenzinduktion, den Proliferationsarrest und die SAHF Entwicklung hat. Im Gegensatz dazu beeinflusste der H2A.J knock-down die Ultrastruktur der DNA-SCARS; was eine potentielle Erklärung für den verminderten SASP darstellen könnte, der mithilfe von ELISA und RT-qPCR nachgewiesen wurde. Untersuchungen an humaner Epidermis zeigten zudem eine Zunahme von H2A.J analog zu einem erhöhten Aufkommen an DNA-Reparaturfoci mit zunehmendem Alter und nach Bestrahlung. Die Analyse niedrig-dosis-exponierter muriner Epidermis wies selbst 6 Monate nach Ende der Bestrahlung eine zunehmende Akkumulation von H2A.J auf, die dem Level einer 18 Monate alten Maus entsprachen. Diese Untersuchungen dienen als Grundlage um Zusammenhänge zwischen der Akkumulation von H2A.J und Bestrahlung zu erforschen und zeigen eine H2A.J-abhängige Induktion des SASP nach Bestrahlung. Schließlich zeigte sich, dass H2A.J als Biomarker für seneszente Zellen in der humanen Epidermis potentiell genutzt werden kann.