Analysis of intracellular transport and functionality of human kidney anion exchanger 1 (kAE1) in yeast and mammalian cells

Abstract

Anion exchanger proteins facilitate chloride-bicarbonate movement across the plasma membrane and play an important role in maintaining acid-base homeostasis in the human body. Kidney anion exchanger 1 (kAE1) is one of the major bicarbonate transporters among this group and helps to reabsorb bicarbonate for chloride in distal nephrons. Defects of this protein result in functional impairment of the anion exchange process that eventually leads to the development of a clinical condition known as distal renal tubular acidosis (dRTA). Although the genetic basis of kAE1 mutants leading to disease is largely known, the precise molecular processes of dRTA pathophysiology are still inadequately understood. Here, the potential of baker’s yeast was evaluated to address various cellular aspects of kAE1 physiology. For the first time, unmodified and tagged full-length versions of kAE1 were successfully expressed in yeast. Moreover, partial localization of the anion exchanger at the plasma membrane was validated by accomplishing several light and confocal microscopy techniques and biochemical assays. Subsequently, biological activity of the protein was demonstrated by performing intracellular pH measurements and chloride uptake assays. Additionally, a set of novel dRTA mutants was characterized in mIMCD3 cells, resembling the closest cellular model to α-intercalated cells. In sum, this study highlights novel possibilities to investigate kAE1-related physiology and pathology in more detail.

Anionenaustauscherproteine erleichtern die Bewegung von Chlorid-Bicarbonat durch die Plasmamembran und spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Säure-Base-Homöostase im menschlichen Körper. Der Anionenaustauscher 1 (kAE1) der Niere ist einer der wichtigsten Bicarbonat-Transporter, der die Resorption von Bicarbonat für Chlorid im distalen Nephron unterstützt. Defekte dieses Proteins führen zu einer Beeinträchtigung des Anionen-Austauschprozesses und zur Entwicklung der distalen renalen tubulären Azidose (dRTA). Obwohl der genetische Hintergrund der krankmachenden kAE1-Mutanten weitgehend bekannt ist, sind die molekularen Prozesse der dRTA-Pathophysiologie nur unzureichend verstanden. In dieser Studie wurde die Bäckerhefe zur Untersuchung zellulärer Aspekte der kAE1-Physiologie eingesetzt. Erstmalig wurden eine unmodifizierte und getaggte kAE1-Volllängenversion erfolgreich in Hefe exprimiert. Darüber hinaus wurde die partielle Lokalisierung des Anionenaustauschers in der Plasmamembran durch Mikroskopietechniken und biochemische Assays validiert. Anschließend wurde die biologische Proteinaktivität durch intrazelluläre pH-Messungen und Chlorid-Aufnahmestudien nachgewiesen. Zusätzlich wurde eine Reihe von neuen dRTA-Mutanten in mIMCD3-Zellen charakterisiert, die als zelluläres Modell den α-interkalierten Zellen am nächsten kommen. Damit eröffnet die vorliegende Dissertation neue Möglichkeiten, die kAE1-Physiologie und -Pathologie genauer untersuchen zu können.