Beobachtungen der Bakterien-Wirts-Interaktion in der Mäuselunge : Eine Untersuchung in vivo

Abstract

Zusammenfassung Bakterielle Infektionen der unteren Atemwege stellen ein ernstzunehmendes Krankheitsbild dar und können zum Tode führen. Der Verlauf einer Pneumonie hängt dabei wesentlich von der Immunantwort des Patienten ab, wobei Alveolarmakrophagen, Monozyten und Granulozyten hier eine zentrale Rolle bei der Phagozytose der Invasoren spielen. Die Abwehrmechanismen in der Alveole sind bisher nicht vollständig bekannt und nur vereinzelt in vivo beobachtet worden. Ziel der vorliegenden Studie war es, mithilfe intravitaler Fluoreszenzmikroskopie die zelluläre Aufnahme von vitalen, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Bakterien in C57BL/6-Mäusen zu untersuchen. Streptococcus pneumoniae als häufigster Erreger der „community acquired pneumonia“ sowie Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus als häufige Pathogene der „hospital acquired pneumonia“ stehen in dieser Arbeit im Fokus [Pletz et al., 2012]. Einer Gruppe von Versuchstieren wurde eine Bakteriensuspension des jeweiligen Stammes intratracheal verabreicht. Die Tiere wurden zuvor narkotisiert, tracheotomiert und beatmet. Dreißig Minuten nach Instillation der Bakterien erfolgte eine Hemithorakotomie nach dem Homburger Modell und die freipräparierte rechte Lunge wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem für die Detektion des Fluoreszenzfarbstoffes geeigneten Filter gefilmt. Es konnten Zellen unterschiedlicher Größe beobachtet werden, die durch die Aufnahme fluoreszenzmarkierter Bakterien unter dem Mikroskop sichtbar wurden. Mithilfe der CapImage-Software wurden die Zellen vermessen, nach Durchmesser differenziert und Zellreihen zugeordnet. Die Zellen wurden quantifiziert und die erhobenen Daten in Microsoft Excel überführt. Bei der Beobachtung der äußeren Alveolen konnten unterschiedlich viele kleine, als residente beziehungsweise rekrutierte Monozyten und neutrophile Granulozyten gewertete Zellen sowie große, als Alveolarmakrophagen gewertete Zellen pro Flächeneinheit detektiert werden. In den Lungen der mit Pneumokokken infizierten Mäuse wurden hierbei im Vergleich zu den anderen Bakterienspezies wesentlich mehr kleine als große fluoreszierende Zellen beobachtet, wohingegen nach der Pseudomonas aeruginosa-Inokulation überwiegend große Zellen in den äußeren Alveolen detektiert wurden. Bei der Infektion mit Staphylokokken konnte insgesamt die höchste Zahl an markierten Zellen beobachtet werden. Zusammenfassend beurteilt weisen unsere Untersuchungen darauf hin, dass die hier getesteten Bakterienspezies unter in vivo Bedingungen durch die in der murinen Lunge präsenten Phagozytenpopulationen unterschiedlich aufgenommen werden. Die Mechanismen, die diesen oben genannten Phänomenen zugrunde liegen sowie deren Bedeutung für die Fähigkeit dieser Bakterienspezies, Pneumonien auszulösen, müssen noch näher untersucht werden. Weiterführende wissenschaftliche Untersuchungen zu diesen Fragestellungen sind mit dem Homburger Modell realisierbar. Mithilfe einer zweiten Gruppe von Versuchstieren wurde der Frage nachgegangen, ob die Phagozytose von Bakterien durch aus dem Blutgefäßsystem eingewanderte Leukozyten in vivo beobachtet werden kann. In tiefer Anästhesie wurde den Tieren ein weiterer Fluoreszenzfarbstoff, welcher in Leukozyten akkumuliert, in den retrobulbären Venenplexus injiziert. Anschließend folgte der Versuchsablauf dem gleichen Protokoll wie in der ersten Versuchsgruppe. Bei den intratracheal instillierten Erregern handelte es sich um fluoreszenzmarkierte Pneumokokken. Die Aufnahmen mit dem Fluoreszenzmikroskop erfolgten unter 2 verschiedenen Filtern, die für die Detektion der einzelnen Fluoreszenzfarbstoffe geeignet waren. Es wurden Aufnahmen der gleichen Lungenabschnitte unter beiden Filtern angefertigt. Anschließend wurden fluoreszenzmarkierte Zellen mithilfe der CapImage-Software vermessen und quantifiziert. Die entstandenen Bildpaare wurden in das Bildbearbeitungsprogramm GIMP 2.8. überführt und unter Berücksichtigung alveolärer und interstitieller Strukturen deckungsgleich übereinander gelegt und miteinander zu einem Bild verschmolzen. Nun wurde bewertet, ob Zellen eine Markierung mit beiden Fluoreszenzfarbstoffen zeigten. Es stellte sich heraus, dass sowohl einzelne große als auch kleine Zellen eine Doppelmarkierung aufwiesen. Demnach können in dieser frühen Phase der Infektion Leukozyten nachgewiesen werden, die aus dem Blutgefäßsystem in pulmonale Strukturen eingewandert sind und bereits Einschlüsse mit fluoreszenzmarkierten Bakterien aufweisen. Die vorliegende Arbeit berichtet über ein Verfahren, mit dem es möglich ist, die Initialphase einer durch Bakterien verursachten Infektion zu beobachten, Bakterien-Phagozyten-Interaktionen zu beurteilen und Unterschiede zwischen verschiedenen Erregern zu quantifizieren sowie die Phagozytose von Erregern durch eingewanderte Leukozyten nachzuweisen. Langfristig soll diese Technik genutzt werden, um die Einflüsse von erregerspezifischen Virulenzfaktoren und molekularen Mechanismen der Immunabwehr im murinen in vivo-Modell zu untersuchen. Dies soll dazu beitragen, den Verlauf einer Infektion besser zu verstehen und auf neue Ansatzpunkte für Therapien hinweisen.

Summary Visualisation of initial host response to bacteria in the lung of living mice In developed countries infections of lower respiratory tract are still one of the most frequently infectious diseases and are a major cause of mortality. Community acquired pneumonia is often caused by Streptococcus pneumoniae whereas Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus play an important role as pathogens in hospital acquired pneumonia [Pletz et al., 2012]. Clinical course and prognosis are affected by initial immune response including cellular host defense. Phagocytes like alveolar macrophages and neutrophils are involved in pathogen clearance. In several in vitro modells phagocytosis has been analysed, but in vivo in the alveoli mechanisms aren’t enough investigated and directly observed. Here, we investigated phagocytosis of different bacteria species by using intravital microscopy of murine lung. That followed a large thoracotomy with observing the alveolar surface for 30 minutes. C57BL/6-Mice were anesthetized, intubated via tracheotomy and ventilated. 100 μl suspensions of fluorescence labelled Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa were injected into the inspiration limb of respirator. Afterwards a large thoracotomy removing the complete anterior part of right hemithorax was performed. Half an hour after application of bacteria imaging was commenced for 30 minutes, using a filter suitable to detect fluorescent dye. The whole surface of the right lung could be investigated. Microscopic images were recorded by a charge-couple device video camera and a video recorder for off-line analysis. Images of each animal were analysed by using capimage software. Next to small bacterias phagocytes appeared in intravital microscopy as bright, large, round structures because of containing intracellular fluorescent bacteria. Based on electron microscopy studies and preliminary studies we differentiate for further evaluation between small and large phagocytes by measuring cellular diameter. Fluorescence labelled cells were ranged. Smaller phagocytes were ranked among neutrophils, larger phagocytes among alveolar macrophages. Animals, infected by P. aeruginosa PA14, showed in contrast to animals infected with Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus, an increasing number of fluorescent alveolar macrophages, whereas most smaller phagocytes were observed in mice contaminated with Streptococcus pneumoniae. In mice infected with Staphylococcus aureus we found the highest number of fluorescent phagocytes. In conclusion several bacteria species were internalized by pulmonary phagocytes in different ways. Partly significant differences were shown. Focusing one bacteria species and observing bacteria mutants unable to express single virulence factors could be enlightening to understand molecular mechanisms of cellular host defense in mice. In other studies we focused on phagocytosis by leucocytes invaded from bloodstream. A fluorescent dye, labelling leucocytes, was injected in retrobulbar blood vessels. Following the same test procedure as before fluorescent labelled bacteria were instilled intratracheally and a preparation was performed. We observed that some labelled leucocytes in pulmonary pneumococci infection could be recorded by the filter set detecting bacterial fluorescent dye. Therefore we could draw the conclusion, that already 30 minutes after infection leucocytes invade pulmonary tissue and contain fluorescent bacteria intracellular. Mechanism explaining these observations must be investigated in further experiments. In this dissertation we report on a method, which has enabled us to observe early cellular host defense in mice in vivo. It offers an promising possibility to investigate and understand molecular mechanisms in pathogen host interaction and can contribute to find new targets for therapy.