Kombination von ArrayCGH und Real-Time-Gendosis-PCR zur Bestimmung neuer Zielgene der Amplifikation beim Prostatakarzinom

Abstract

Das Prostatakarzinom ist in Deutschland der am häufigsten diagnostizierte Tumor des Man-nes. Durch verstärkten Einsatz des diagnostischen Markers PSA (prostataspezifisches Anti-gen) und frühzeitige Entnahme von Stanzbiopsaten ist seine Inzidenz in den letzten Jahren stark gestiegen. Daraus ergibt sich eine große Anzahl an Überdiagnosen, gefolgt von neben-wirkungsträchtigen Übertherapien, die dem Patienten bei langsamem (indolentem) Tumor-wachstum ohne Metastasierungstendenz hätten erspart bleiben können. Zurzeit existiert für das Prostatakarzinom kein verlässlicher prognostischer Marker, der be-reits im Frühstadium der Erkrankung das spätere Wachstums- und Metastasierungsverhalten des Tumors erfasst. Auch fehlt es an einem potenten tumorspezifischen Diagnostikmarker mit größerer Aussagekraft als der des PSA. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe eines Oligonukleotid-basierten MicroArrays von der Norm abweichende Genkopienzahlen in Prostatakarzinomzelllinien zu erkennen und somit neue, für die Prostatakarzinogenese relevante Gene zu identifizieren. Die Genome von sieben Prostatakarzinomzelllinien (PC3, PC3-N, DU145, DU145-MN1, CWR22, CWR22-RV1, LNCaP) wurden in einer hochauflösenden Oligonukleotid-CGH (com-parative genomische Hybridisierung) nach Genregionen mit Kopienzahlgewinn oder –verlust durchsucht. Verglichen mit früheren Ergebnissen aus konventioneller chromosomaler CGH wurden in der ArrayCGH vor allem nahe der Zentromere und der Telomere mehr Deletionen und kleine Gengewinne entdeckt. Eine 1,7 Mb umfassende amplifizierte Region auf Chromosom 9p13.3 in den Zelllinien CWR22 und CWR22-RV1 wurde nur mit der höherauflösenden ArrayCGH gefunden. Der Kopienzahlgewinn in dieser Genregion wurde mithilfe des für diese Region kodierenden BACs RP11-165H19 in einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung bestätigt. Das BAC-Genom enthält die beiden benachbarten Gene IL11RA und DCTN3. In einer quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR) konnten wir zeigen, dass IL11RA deutlich höhere Genkopienzahlen in den Tumorzelllinien erreicht als das Nachbargen DCTN3 und somit höchstwahrscheinlich das relevante Gen dieser amplifizierten Region darstellt. Die qRT-PCR-Untersuchung von zwanzig primären Prostatakarzinomen aus radikalen Prostatek-tomien ergab einen Kopienzahlgewinn von IL11RA in 75% der untersuchten Proben. Ein Ko-pienzahlgewinn von DCTN3 wurde nur in zwei Fällen gemeinsam mit einem IL11RA-Gewinn detektiert. 3 IL11RA konnte als Zielgen der in maligne entarteten Prostatazellen hochamplifizierten peri-zentromerischen Chromosomenregion 9p13.3 identifiziert werden. Das Gen kodiert für den α-Rezeptor von Interleukin 11. Über eine durch Glykoprotein 130 (gp 130) vermittelte Aktivierung des JAK/STAT-Signalwegs und nachfolgende konstitutive Aktivierung von STAT-Proteinen (hauptsächlich STAT 3) leistet es einen wesentlichen Beitrag zur Prostatakarzinogenese und zum Wandel vom hormonsensiblen zum hormonrefraktären Wachstum (Kamradt J et al., 2007). Zudem wurde das Produkt des hochregulierten IL11RA-Gens mittlerweile als Angriffspunkt einer gezielten Pharmakotherapie des ossär metastasier-ten Prostatakarzinoms identifiziert (Pasqualini R et al., 2015).

Detection of Novel Amplicons in Prostate Cancer by Combination of Oligonucleotide-Based ArrayCGH with Quantitative Real-Time-PCR In Germany, prostate carcinoma is the most frequently diagnosed tumor of men. Due to the increased use of the diagnostic biomarker PSA (prostate specific antigen) and early taking of punch biopsies the incidence has been rising in recent years. This leads to a vast number of overdiagnoses resulting in overtreatments with undesirable side effects. These could have been avoided in the case of indolent tumor growth with low metastatic potential. At present, there is no reliable prognostic marker at early tumor stage to predict the tumor growth and metastasis at later stages. In addition, we need a better and more conclusive tumor specific diagnostic marker than PSA. The objective of this study was to profile gene copy number alterations in prostate cancer cell lines in order to identify novel candidate genes, which might play a role in prostate carcino-genesis. Genome-wide screening for regions of gene gains and losses on seven prostate cancer cell lines (PC3, PC3-N, DU145, DU145-MN1, CWR22, CWR22-RV1, and LNCaP) was carried out using high-resolution comparative genomic hybridization on a 35,000-feature oligonucle-otide microArray (ArrayCGH). Compared to conventional chromosomal CGH, more deletions and small regions of gains, particularly in pericentromeric regions and regions next to the telomeres, were detected. Most importantly, a small amplicon of 1.7 MB at 9p13.3 in the cell lines CWR22 and CWR22-RV1 could only be identified using the high-resolution ArrayCGH. The copy number gain in this region was confirmed by fluorescence in situ hybridization using the BAC clone RP11-165H19 from the amplified region comprising the two genes in-terleukin 11 receptor alpha (IL11RA) and dynactin 3 (DCTN3). Using quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR) we demonstrated that IL11RA reached signifi-cantly higher gene copy numbers in the cell lines compared to DCTN3. This strongly indi-cates that IL11RA is the amplification target. In addition, screening of 20 primary prostate carcinomas by qRT-PCR revealed an IL11RA copy number gain in 75% of the tumors analyzed. In contrast, gain of DCTN3 was only found in two cases and only together with a gain of IL11RA. IL11RA could be identified as the target gene of the highly amplified chromosomal region 9p13.3 in prostate cancer cell lines and primary prostate cancer samples. IL11RA encodes a specific α-receptor for Interleukin 11. An important signaling pathway ac-tivated by IL11RA is the JAK/STAT-pathway (Janus kinase-signal transducer and activator of transcription). Gp130 (glycoprotein 130)-dependent activation of the JAK/STAT-pathway fol-lowed by constitutive STAT3 activation was demonstrated to play a key role in prostate car-cinogenesis and progression of hormone sensitive to hormone refractory growth of prostate cancer (Kamradt J et al., 2007). In addition, the product of the upregulated IL11RA gene has now been identified as the target of selective pharmacotherapy for osseous metastatic prostate cancer (Pasqualini R et al., 2015).