Human sperm chromatin condensation assessment using Raman spectroscopy and its impact on ICSI induced fertilization and embryonic development

Abstract

The status of human sperm chromatin has become an important parameter in male fertility evaluation. Chromatin condensation of the sperm genome is necessary for the reproduction process. It causes inactivation of most of the spermatid’s genes and protects DNA from chemical and physical damage. It is evident that the typical composition of sperm chromatin is fundamental to maintain DNA integrity and therefore its ability to fertilize the egg. Fertilization with sperm that possess improper chromatin condensation may have a negative effect on early embryonic growth or lead to the development of genetic diseases. Chromatin condensation evaluation using the current methods is based on staining procedures, rendering the assessed sample unusable for assisted reproductive technology procedures. The current study aims to evaluate the ability of Raman spectroscopy as a non-invasive technique to detect any chemical changes in the normal morphology sperm that are usually selected and used during the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) procedure. In addition, the protamine deficiency, histone retention, DNA fragmentation, ICSI outcomes and semen parameters were also assessed and tested for correlation with the obtained Raman spectral data or Raman quantitative parameters. Sperm samples of 85 donors were evaluated. Donor consent and approval from an Ethics Committee were given. The Raman peaks at 1098 cm-1, 1334 cm-1, 1372 cm-1 and 1532 cm-1 show a significant difference between the fertile and sub-fertile groups. The Raman peaks at 670 cm-1, 731 cm-1, 785 cm-1, 1062 cm-1, 1098 cm-1, 1185 cm-1, 1372 cm-1, 1424 cm-1, 1450 cm-1, 1532 cm-1, 1618 cm-1 and 1673 cm-1 show a significant difference between the CMA3≤41 and CMA3>41 groups. The Raman peaks at 670 cm-1, 731 cm-1, 1062 cm-1, 1098 cm-1, 1185 cm-1, 1372 cm-1, 1424 cm-1, 1618 cm-1 and 1673 cm-1 show a significant difference between the CMA3<28, 28≤CMA3≤50 and CMA3>50 groups. The CMA3-numbers indicate the percentage of stained cells. The relative DNA content, DNA/protein ratio and protein content standard deviation show a significant difference between the fertile and sub-fertile groups. The relative protein content, relative DNA content, DNA/protein ratio and protein standard deviation show a significant difference between the CMA3≤41 and CMA3>41 groups. The relative protein content, relative DNA content, DNA/protein ratio and protein standard deviation show a significant difference between the CMA3<28, 28≤CMA3≤50 and CMA3>50 groups. Protamine deficiency, evaluated by chromomycin A3 staining, was significantly correlated with the relative protein content, relative DNA content, DNA/protein ratio and protein standard deviation. Histone retention, evaluated by aniline blue staining, was significantly correlated with the relative protein content, relative DNA content, DNA/protein ratio, protein standard deviation, DNA standard deviation and DNA/protein ratio standard deviation. DNA fragmentation that was evaluated by acridine orange staining was significantly correlated with the relative protein content, relative DNA content, DNA/protein ratio, protein standard deviation, DNA standard deviation and DNA/protein ratio standard deviation. The fertilization rate was significantly correlated with the relative protein content, relative DNA content, DNA/protein ratio, protein standard deviation, DNA standard deviation and DNA/protein ratio standard deviation. The cleavage score was significantly correlated with the relative DNA content and protein content standard deviation. The embryo development score was significantly correlated with the relative protein content and relative DNA content. In conclusion, the Raman spectroscopic measurements, both the individual Raman peak analysis or the Raman quantitative parameter analysis, represent a promising diagnostic tool that has the ability to label-free detect sperm with chromatin abnormalities, such as improper chromatin condensation and DNA fragmentation to a certain degree similar to that of the existing staining techniques at the individual cell level. Furthermore, it has the ability to predict estimated ICSI outcomes. The Raman spectral analysis and the Raman quantitative parameters, obtained from normal morphology sperm, showed great differences and variation indicating that Raman spectroscopy has the ability to detect the presence of immature sperm and even some hidden abnormalities resulting from disturbances during spermatogenesis.

Der Zustand des Chromatins im menschlichen Spermium wird ein immer wichtigerer Parameter in der Diagnostik der männlichen Fertilität. Die Kondensation der DNS des Spermiengenoms in das Chromatin ist ein notwendiger Vorgang für den Fortpflanzungsprozess. Es deaktiviert die meisten Gene im Spermatid und schützt die DNS vor schädlichen chemischen und physikalischen Einflüssen. Es ist offensichtlich, dass die typische Zusammensetzung des Chromatins des Spermiums von großer Bedeutung für die Integrität des Genoms und damit für die spätere Fähigkeit zur Befruchtung ist. Eine Befruchtung durch ein Spermium mit fehlerhafter Chromatinstruktur kann negative Auswirkungen auf die frühe embryonale Entwicklung haben oder zu genetischen Defekten führen. Heutzutage basiert die Untersuchung der Kondensation des Chromatins auf Färbemethoden, die aber die untersuchten Zellen für eine Weiterverwendung zum Zwecke der künstlichen Befruchtung unbrauchbar machen. Diese Arbeit hat daher zum Zwecke die Raman- Spektroskopie als eine nichtinvasive Methode zur Untersuchung der chemischen Zusammensetzung des Chromatins von morphologisch normalen Spermien, wie man sie zur künstlichen Befruchtung mit Hilfe der ICSI einsetzt, zu evaluieren. Zusätzlich wurden Protamindefizienz, Histonrückhaltung, DNSFragmentierung, ICSI Erfolg sowie Sperma-Parameter aus dem Spermiogramm untersucht und auf Korrelation mit ramanspektroskopischen Daten oder den Parametern eines quantitativen parametrischen Modells der Spektren getestet. Es wurden Spermien von 85 Versuchsteilnehmern untersucht. Die Spender haben der Teilnahme zugestimmt. Es liegt positives Votum der zuständigen Ethikkommission vor. Die Raman Peaks bei 1098 cm-1, 1334 cm-1, 1372 cm-1 und 1532 cm-1 zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen der fertilen und der subfertilen Spendergruppe. Die Ramanpeaks bei 670 cm-1, 731 cm-1, 785 cm-1, 1062 cm-1, 1098 cm-1, 1185 cm-1, 1372 cm-1, 1424 cm-1, 1450 cm-1, 1532 cm-1, 1618 cm-1 und 1673 cm-1 zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen der CMA3≤41 und der CMA3>41 Spendergruppe. Die Ramanpeaks bei 670 cm-1, 731 cm-1, 1062 cm-1, 1098 cm-1, 1185 cm-1, 1372 cm-1, 1424 cm-1, 1618 cm-1 und 1673 cm-1 zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den Spendergruppen CMA3<28, 28≤CMA3≤50 und CMA3>50. Die CMA3-Zahlen entsprechen dem prozentualen Anteil an CMA3-gefärbten Zellen der jeweiligen Spender der Gruppe. Der relative DNS-Gehalt, DNS-zu-Protein-Verhältnis, sowie die Standardabweichung des Protein-Gehalts zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen der fertilen und der subfertilen Spendergruppe. Der relative Protein-Gehalt, relativer DNS-Gehalt, DNS-zu-Protein-Verhältnis, sowie die Standardabweichung des Protein-Gehalts zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen der CMA3≤41 und der CMA3>41 Spendergruppe. Der relative Protein-Gehalt, relativer DNS-Gehalt, DNS-zu-Protein-Verhältnis, sowie die Standardabweichung des Protein-Gehalts zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen den CMA3<28, 28≤CMA3≤50 und CMA3>50 Spendergruppen. Protamindefizienz, untersucht mit einer Chromomycin-A3-Färbung, korreliert signifikant mit dem relativen Protein-Gehalt, relativem DNS-Gehalt, DNS-zu-Protein-Verhältnis, sowie der Standardabweichung des Protein-Gehalts. Histonrückhaltung, untersucht mit einer Anilin-Blau-Färbung, korreliert signifikant mit dem relativen Protein-Gehalt, relativem DNS-Gehalt, DNS-zu-Protein-Verhältnis, der Standardabweichung des Protein-Gehalts, der Standardabweichung des DNS-Gehalts, sowie der Standardabweichung des DNS-zu-Protein-Verhältnisses. DNS-Fragmentierung, untersucht mit einer Acridin-Orange-Färbung, korreliert signifikant mit dem relativen Protein-Gehalt, relativem DNS-Gehalt, DNS-zu-Protein-Verhältnis, der Standardabweichung des Protein-Gehalts, der Standardabweichung des DNS-Gehalts, sowie der Standardabweichung des DNS-zu-Protein-Verhältnisses. Die Befruchtungsrate korreliert signifikant mit dem relativen Protein-Gehalt, relativem DNS-Gehalt, DNSzu- Protein-Verhältnis, der Standardabweichung des Protein-Gehalts, der Standardabweichung des DNSGehalts, sowie der Standardabweichung des DNS-zu-Protein-Verhältnisses. Der Teilungsscore korreliert signifikant mit dem relativem DNS-Gehalt, sowie der Standardabweichung des Protein-Gehalts. Der Embryonenscore korreliert signifikant mit dem relativem Protein-Gehalt sowie dem relativen DNS-Gehalt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ramanspektroskopie, sowohl in Form einer einfachen Peakanalyse als auch in Form eines quantitativen parametrischen Modells, eine vielversprechende Methode darstellt, die ähnlich zu den etablierten Färbemethoden in der Lage ist Veränderungen im Chromatin einzelner Spermien ohne vorherige Markierung zu untersuchen. Zusätzlich ist sie in der Lage den Erfolg einer ICSI-Behandlung vorab abzuschätzen. Die Raman-Spektren und die Parameter des quantitativen parametrischen Modells morphologisch normaler Spermien weisen eine große Varianz und deutliche Unterschiede auf. Dies deutet darauf hin, dass die Ramanspektroskopie in der Lage ist, unreife Spermien sowie verdeckte Anomalitäten auf Grund von Störungen während der Spermatogenese zu detektieren.