Analyses of human endogenous retrovirus-encoded proteins with potential relevance for human biology and diseases

Abstract

The human genome harbors numerous sequences derived from ancient retroviral infections, so-called human endogenous retroviruses (HERVs). The HERVs of the HERV-K(HML-2) group, in short HML- 2, encode various retroviral proteins that, if expressed, may affect cell biology. HML-2 transcription is upregulated in different disease contexts including presence of HML-2 encoded proteins. Some HML-2 proteins have been implicated in disease development, although definitive associations with diseases were not reported yet. This work focused on HML-2 protease (Pro) and HML-2 integrase (IN), two HML-2 encoded proteins that received little attention so far, although their enzymatic activities can, in principle, have detrimental effects in the cell. In the first part of this work we investigated HML-2 Pro. Besides the retroviral proteins that constitute the virion, some retroviral aspartyl proteases, among them HIV-1 protease, are known to process cellular proteins. We wondered whether HML-2 Pro proteolytic activity can process cellular proteins as well. By cleaving cellular proteins, HML-2 Pro may impair cellular processes, thus have a role in disease development. The major aim for this part was to identify cellular proteins processed by HML- 2 Pro. We also performed initial experiments documenting HML-2 Pro activity against cellular proteins in a cellular environment and provided insights into cellular processes that could be potentially influenced by HML-2 Pro activity. HML-2 Pro was successfully purified and reaction conditions for assaying its activity in vitro were optimized. Purified HML-2 Pro was incubated with cellular proteins derived from HeLa cells. Employing terminal amine isotope labeling of substrates (TAILS) we then identified cellular proteins cleaved by HML-2 Pro. TAILS experiment and subsequent analyses of raw data produced a list of 872 human proteins as putative cellular substrates of HML-2 Pro. Identified proteins were profiled using suited bioinformatic tools. Processed proteins could be assigned to different cellular compartments and various, often disease-relevant cellular processes. We verified through additional experiments processing of selected candidate proteins by HML-2 Pro in vitro and in vivo. Cleavage by HML-2 Pro was confirmed for 9 out of 14 selected candidate proteins in vitro. Further verification experiments demonstrated in vivo cleavage of cellular proteins by HML-2 Pro in a cellular environment. Sizes of processing products observed for some of the tested proteins coincided with product sizes predicted by TAILS, thus corroborating TAILS results. We documented cell death and activation of apoptotic processes during HML-2 Pro overexpression, hence providing initial experimental evidence of cellular processes being influenced by HML-2 Pro activity. Finally, we obtained preliminary evidence of functional, enzymatically active endogenous HML-2 Pro being present in some tumor cell lines known to express HML-2 proteins. Our results suggest that hundreds of cellular proteins are potential substrates of HML-2 Pro. It is therefore conceivable that upregulated HML-2 transcription might lead to increased expression of active HML-2 Pro that might subsequently affect various cellular processes by degrading cellular proteins. HML-2 Pro is present in cells of some tumor types where its proteolytic activity could play a role. HML-2 Pro thus deserves further attention because cellular processes impaired by its activity potentially contribute to human diseases. In the second part of this work we investigated HML-2 IN, an enzyme that, if expressed, might locate to the cell nucleus and exhibit catalytic activities inducing DNA damage and formation of DNA double-strand breaks (DSBs). DSBs are a severe type of DNA damage that may contribute to genome instability and tumor development. We aimed at evaluating whether HML-2 IN causes DNA damage resulting in formation of DSBs. Following transient expression of HA-tagged wild-type and mutant HML-2 IN in HeLa cells, we performed immunofluorescence assays for monitoring HML-2 IN cellular localization through HA- tag detection as well as formation of DSBs through analysis of 53BP1 foci. Transiently expressed HML-2 IN localized to nuclei but we did not observe significant differences regarding 53BP1 foci when comparing cells expressing wild-type HML-2 IN and controls. Although our results point towards HML-2 IN not causing DSBs when expressed in HeLa cells the experimental approach that we established can be considered a valuable starting point for further, more comprehensive investigations.

Das menschliche Genom enthält zahlreiche Sequenzen, die von ehemaligen retroviralen Infektionen stammen, sogenannte humane endogene Retroviren (HERVs). Die HERVs der HERV-K (HML-2) Gruppe, kurz HML-2, kodieren verschiedene retrovirale Proteine, die, wenn sie exprimiert werden, die Zellbiologie beeinflussen können. Die HML-2 Transkription wird in verschiedenen Krankheitskontexten hochreguliert, einschließlich der Expression HML-2-kodierter Proteinen. Einige HML-2 Proteine sind eventuell an der Entwicklung bestimmter Krankheiten beteiligt, obwohl definitive Assoziationen mit solchen Krankheiten noch nicht beschrieben sind. Diese Arbeit konzentrierte sich auf HML-2 Protease (Pro) und HML-2 Integrase (IN), zwei HML-2 kodierte Proteine, die bisher wenig Beachtung fanden, obwohl ihre enzymatischen Aktivitäten im Prinzip schädliche Auswirkungen auf die Zelle haben können. Im ersten Teil dieser Arbeit haben wir HML-2 Pro untersucht. Es ist bekannt, dass neben den retroviralen Virion-bildenden Proteinen einige retrovirale Aspartylproteasen, darunter die HIV-1- Protease, auch noch zelluläre Proteine spalten können. Es bestand die Frage, ob die proteolytische Aktivität von HML-2 Pro auch zelluläre Proteine spalten kann. Durch die Spaltung von zellulären Proteinen kann HML-2 Pro zelluläre Prozesse beeinträchtigen und somit eine Rolle bei der Krankheitsentwicklung spielen. Das Hauptziel dieses Teils der Arbeit war die Identifizierung von zellulären Proteinen, die von HML-2 Pro prozessiert wurden. Wir führten auch erste Experimente durch, die die HML-2 Pro Aktivität gegen zelluläre Proteine in einer zellulären Umgebung dokumentierten, und lieferten Einblicke in zelluläre Prozesse, die möglicherweise durch die HML-2 Pro Aktivität beeinflusst werden könnten. HML-2 Pro wurde erfolgreich gereinigt und die Reaktionsbedingungen zum Testen seiner Aktivität in vitro wurden optimiert. Gereinigtes HML-2 Pro wurde mit zellulären nativen Proteinen aus HeLa- Zellen inkubiert. Unter Verwendung der terminalen Aminisotopenmarkierung von Substraten (TAILS) identifizierten wir zelluläre Proteine, die durch HML-2 Pro prozessiert wurden. Das TAILS- Experiment und die anschließende Analyse der Rohdaten ergaben eine Liste von 872 humanen Proteinen als mutmaßliche zelluläre Substrate von HML-2 Pro. Die dentifizierten Proteine wurden unter V erwendung geeigneter bioinformatischer Werkzeuge charakterisiert. Die identifizierten Proteine konnten verschiedenen Zellkompartimenten und verschiedenen, oft krankheitsrelevanten Zellprozessen zugeordnet werden. Wir verifizierten ferner durch zusätzliche Experimente die Prozessierung ausgewählter Kandidatenproteine durch HML-2 Pro in vitro und in vivo. Eine solche Prozessierung durch HML-2 Pro wurde für 9 von 14 ausgewählten Kandidatenproteinen in vitro bestätigt. Weitere Verifikationsexperimente zeigten in vivo die Prozessierung von zellulären Proteinen durch HML-2 Pro in einer zellulären Umgebung. Die Größen der für einige der getesteten Proteine beobachteten Prozessierungsprodukte stimmten hierbei mit den von TAILS vorhergesagten Produktgrößen überein, was die TAILS-Ergebnisse bestätigte. Wir dokumentierten weiter den Zelltod und die Aktivierung apoptotischer Prozesse während der Überexpression von HML-2 Pro und lieferten damit erste experimentelle Beweise, dass zelluläre Prozesse durch die HML-2 Pro-Aktivität beeinflusst werden. Schließlich erhielten wir vorläufige Beweise dafür, dass funktionelles, enzymatisch aktives endogenes HML-2 Pro in einigen Tumorzelllinien, von denen HML-2 Proteinexpression bekannt ist, ebenso exprimiert wird. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Hunderte von zellulären Proteinen potenzielle Substrate von HML- 2 Pro sind. Es ist daher denkbar, dass hochregulierte HML-2 Transkription zu einer erhöhten Expression von aktivem HML-2 Pro führt, die anschließend verschiedene zelluläre Prozesse durch Abbau zellulärer Proteine beeinflussen könnte. HML-2 Pro ist in Zellen einiger Tumortypen vorhanden, in denen seine proteolytische Aktivität eine Rolle spielen könnte. HML-2 Pro verdient daher weitere Aufmerksamkeit, da zelluläre Prozesse, die durch seine Aktivität beeinträchtigt werden, möglicherweise zu menschlichen Krankheiten beitragen. Im zweiten Teil dieser Arbeit untersuchten wir HML-2 IN, ein Enzym, das bei Expression im Zellkern lokalisieren und katalytische Aktivitäten aufweisen könnte, die eine DNA-Schädigung und die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) induzieren. DSBs sind eine schwerwiegende Art von DNA- Schäden, die zur Instabilität des Genoms und zur Tumorentwicklung beitragen können. Wir wollten untersuchen, ob HML-2 IN DNA-Schäden verursacht, die zur Bildung von DSBs führen. Nach der Expression von HA-markiertem Wildtyp- und mutiertem HML-2 IN in HeLa-Zellen führten wir Immunfluoreszenzexperimente zur Untersuchung der HML-2 IN-Zelllokalisation durch HA-Tag- Detektion sowie zur Analyse der Bildung von DSBs durch Analyse von 53BP1-Foci durch. Transient exprimiertes HML-2 IN lokalisiert im Zellkern, jedoch beobachteten wir keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf 53BP1-Foci im Vergleich von Zellen, die Wildtyp-HML-2 IN oder Kontrollen exprimierten. Obwohl unsere Ergebnisse darauf hindeuten, dass HML-2 IN bei Expression in HeLa-Zellen keine DSBs verursacht, kann der von uns etablierte experimentelle Ansatz als wertvoller Ausgangspunkt für weitere, umfassendere Untersuchungen angesehen werden.