Einfluss fraktionierter Niedrig-Dosis-Bestrahlung auf die Neurogenese des adulten und juvenilen Hippocampus

Abstract

Radiotherapie mit ionisierender Strahlung stellt eine wirkungsvolle Behandlungsmethode dar, um Tumorwachstum effektiv zu kontrollieren. Über die Anpassung des Bestrahlungsfeldes an die Tumorkontur durch verschiedene Einstrahlrichtungen und die fraktionierte Applikation von Strahlendosen wird eine optimale Tumorkontrolle mit gleichzeitiger Minimierung der Normalgewebstoxizitäten gewährleistet, da nur der Tumor hohen Strahlendosen und das umliegende gesunde Gewebe niedrigen Strahlendosen ausgesetzt ist. Die Effekte und Konsequenzen niedriger Strahlendosen wurden bisher nur unzureichend untersucht. Da jedoch bereits kognitive Beeinträchtigungen nach einer pädiatrischen Radiotherapie zu beobachten waren, sollten Auswirkungen niedriger Strahlendosen stärker in den Fokus aktueller Forschungen treten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Auswirkungen fraktionierter Niedrig-Dosis-Bestrahlung mit 0.1 Gy auf den Hippocampus und die adulte Neurogenese charakterisiert. Hierbei wurden sowohl juvenile (11 Tage alte), als auch adulte (8 Wochen alte) gesunde C57BL6-Mäuse bestrahlt. Die Untersuchungen fanden während der Bestrahlung (72 Stunden) sowie lange nach Bestrahlungsende (1 Monat, 3 Monate und 6 Monate) statt, um auch mögliche Spätfolgen zu erfassen. Für die Analyse der DNA-Schadensantwort wurden persistierende 53BP1-Foci quantifiziert, wobei eine Foci-Akkumulation mit steigender kumulativer Dosis und ein erhöhtes Foci-Level bis zu 3 Monate nach Bestrahlung im Vergleich zur altersgerechten Kontrolle nachgewiesen werden konnten. Potenzielle Auswirkungen auf die adulte Neurogenese wurden durch Immunfluoreszenzmarkierungen von Stamm- (SOX2) und Vorläuferzellen (DCX) analysiert. Bereits drei Tage nach der niedrigsten applizierten Dosis (5x0.1 Gy) lag die proliferierende Vorläuferzellpopulation deutlich vermindert vor und auch ihre dendritische Arborisation war signifikant reduziert. Beide Abnahmen waren bis zu sechs Monate nach Bestrahlung eindeutig nachweisbar. Eingeschränkte Arborisation impliziert eine beeinträchtigte neuronale Verschaltung und Konnektivität der Vorläuferzellen. Die verminderte synaptische Plastizität setzte sich ebenfalls auf neuronaler Ebene durch die reduzierte Expression von PSD-95 fort. Im Gegensatz zu den Vorläuferzellen lag die Stammzellpopulation erst einen Monat nach Applikation der letzten Dosisfraktion deutlich dezimiert vor und blieb es, zumindest in den juvenil-bestrahlten Mäusen, bis zu sechs Monate nach Bestrahlung. Fraktionierte Niedrig-Dosis-Bestrahlung führt somit zu einer starken Beeinträchtigung der Neurogenese. Diese Annahme wurde durch eine umfassende Proteomanalyse juvenil-bestrahlter Hippocampi belegt, die unter anderem eine Deregulation des CREB-Signalweges zeigte. CREB ist sowohl für die Neurogenese als auch für die synaptische Plastizität entscheidend. Aufgrund der ebenfalls neuroprotektiven Funktion von CREB wurde weiterhin mithilfe verschiedener Immunfluoreszenzmarker der Einfluss auf die Neuroinflammation und Gliazellen eruiert. Fraktionierte Niedrig-Dosis-Bestrahlung nahm auf die verschiedenen Gliazellen Einfluss, indem sowohl die Mikroglia- (IBA1) als auch die Oligodendrozyten-Population (OLIG2) in den bestrahlten Proben stark erhöht vorlagen. Auch die Astrozyten (GFAP) zeigten zunächst (72h) eine deutliche Zunahme, bevor sie einen Monat nach Bestrahlung stark dezimiert vorlagen. Die Markierung mit BrdU offenbarte zudem eine Änderung des Zellschicksals von der Neurogenese hin zur Gliogenese, da markierte Stammzellen nach Bestrahlung eher in einen glialen Phänotyp aus-differenzierten. Um herauszufinden, ob die strahlungsinduzierten Veränderungen bereits durch nicht-invasive Methoden feststellbar sind, wurden zusätzlich verschiedene MRT-Untersuchungen durchgeführt. Diese zeigten einen erhöhten zerebralen Blutfluss, sowie er-höhte T1- und T2-Relaxationszeiten im Hippocampus nach Bestrahlung, was indikativ für eine Entzündung oder Zellatrophie steht, wie sie bereits durch die immunhistologischen Experimente gezeigt werden konnte. Die tierexperimentellen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit offenbaren eine Beeinträchtigung der adulten Neurogenese durch repetitive Exposition mit niedrigen Strahlendosen. Die Entstehung neuer Neurone wurde stark eingeschränkt und auch das Verhältnis der Gliazellen lag nach Bestrahlung gestört vor, was beides eine verminderte synaptische Plastizität und damit kognitive Beeinträchtigung zur Folge haben könnte. Die vorliegende Arbeit verdeutlicht die Relevanz für Untersuchungen von Niedrig-Dosis exponiertem Gehirngewebe, um potenzielle Nebenwirkungen einer Strahlentherapie benennen und möglicherweise reduzieren zu können. Aufgrund der ausgeprägteren Effekte in jungen Hippocampi sollte dieser während einer Radiotherapie möglichst maximal geschont werden. Ionizing radiation is an effective treatment modality utilized in radiotherapy for tumor growth control. Optimized tumor control with minimal normal tissue toxicity is achieved through ad-justments of the irradiation field with multiple photon-beams from varying directions, as well as, fractionated application of radiation dose. Consequently, a high dose is delivered to the tumor while surrounding tissue is spared and exposed only to low radiation doses. However, consequences of such low-dose radiation (LDR) are, to date, unknown and as cognitive im-pairments following pediatric radiotherapy have been observed, an increased focus of current research is required. The scope of this work was to determine the effects of fractionated LDR with 0.1 Gy on the hippocampus, focusing specifically on adult neurogenesis. For this purpose both juvenile, 11 days old at beginning of irradiation, and adult, 8 weeks old, healthy C57BL6-mice were ana-lyzed. Analysis took place 72 hours after irradiation, and to study late effects, 1 month, 3 months and 6 months after irradiation. DNA damage response was analyzed by 53BP1-foci quantification in neurons which revealed foci accumulation with increasing cumulative doses and elevated foci levels in irradiated samples detectable as late 3 months following irradiation. Potential consequences for adult neurogenesis were determined by immunofluorescence staining of stem- (SOX2) and neuroprogenitor cells (DCX). Proliferating neuroprogenitors al-ready declined three days after application of the lowest dose (5x0.1 Gy) and, additionally, their dendritic arborisation was significantly reduced. These effects were present until 6 months after irradiation. Diminished arborisation may implicate impaired neuronal connectivity and less synaptic plasticity, which was also shown on a neuronal level by the reduced expres-sion of PSD-95. In contrast, stem cells did not decline until one month after irradiation and at least in the juvenile mice, remained low until 6 months after irradiation. Thus, fractionated LDR has a major impact on adult neurogenesis, which was further confirmed by proteomic assay. This showed, amongst others, deregulated CREB signaling. CREB signaling plays a crucial role in adult neurogenesis, synaptic plasticity and also neuroprotection. Due to its in-volvement in neuroprotection, the impact on neuroinflammation and glial cells was investigat-ed by immunofluorescence staining of different glia markers. Fractionated LDR strongly in-fluenced glial cells by increasing microglia (IBA1) and oligodendrocyte (OLIG2) populations. Additionally, astrocytes (GFAP) increased initially (72h), followed by a drastic decline. Label-ing mice with BrdU enabled observation of a cell fate shift from neurogenesis to gliogenesis induced by LDR. Functional MRI was performed to demonstrate that the ascertained changes could be determined by non-invasive methods. Higher cerebral blood flow and increased T1- and T2- relaxation time was detected which may indicate inflammation or cell atrophy. The animal experiments of this present work identified that repeated exposition to low radia-tion doses induced strong impairment in adult neurogenesis. Formation of new neurons was notably restricted and the proportion of glial cells was affected, both of which can lead to re-duced synaptic plasticity and thereby to cognitive impairment. These results illustrate the rele-vance of low dose exposed tissue analysis to determine potential side effects of radiotherapy and to possibly reduce them. As juvenile patients show more pronounced side effects and longer life expectancy, all efforts should be made to treat the hippocampus with maximum care.

Ionizing radiation is an effective treatment modality utilized in radiotherapy for tumor growth control. Optimized tumor control with minimal normal tissue toxicity is achieved through adjust-ments of the irradiation field with multiple photon-beams from varying directions, as well as, fractionated application of radiation dose. Consequently, a high dose is delivered to the tumor while surrounding tissue is spared and exposed only to low radiation doses. However, conse-quences of such low-dose radiation (LDR) are, to date, unknown and as cognitive impairments following pediatric radiotherapy have been observed, an increased focus of current research is required. The scope of this work was to determine the effects of fractionated LDR with 0.1 Gy on the hippocampus, focusing specifically on adult neurogenesis. For this purpose both juvenile, 11 days old at beginning of irradiation, and adult, 8 weeks old, healthy C57BL6-mice were ana-lyzed. Analysis took place 72 hours after irradiation, and to study late effects, 1 month, 3 months and 6 months after irradiation. DNA damage response was analyzed by 53BP1-foci quantification in neurons which revealed foci accumulation with increasing cumulative doses and elevated foci levels in irradiated samples detectable as late 3 months following irradiation. Potential consequences for adult neurogenesis were determined by immunofluorescence staining of stem- (SOX2) and neuroprogenitor cells (DCX). Proliferating neuroprogenitors al-ready declined three days after application of the lowest dose (5x0.1 Gy) and, additionally, their dendritic arborisation was significantly reduced. These effects were present until 6 months after irradiation. Diminished arborisation may implicate impaired neuronal connectivity and less synaptic plasticity, which was also shown on a neuronal level by the reduced expression of PSD-95. In contrast, stem cells did not decline until one month after irradiation and at least in the juvenile mice, remained low until 6 months after irradiation. Thus, fractionated LDR has a major impact on adult neurogenesis, which was further confirmed by proteomic assay. This showed, amongst others, deregulated CREB signaling. CREB signaling plays a crucial role in adult neurogenesis, synaptic plasticity and also neuroprotection. Due to its involvement in neu-roprotection, the impact on neuroinflammation and glial cells was investigated by immunofluo-rescence staining of different glia markers. Fractionated LDR strongly influenced glial cells by increasing microglia (IBA1) and oligodendrocyte (OLIG2) populations. Additionally, astrocytes (GFAP) increased initially (72h), followed by a drastic decline. Labeling mice with BrdU ena-bled observation of a cell fate shift from neurogenesis to gliogenesis induced by LDR. Func-tional MRI was performed to demonstrate that the ascertained changes could be determined by non-invasive methods. Higher cerebral blood flow and increased T1- and T2- relaxation time was detected which may indicate inflammation or cell atrophy. The animal experiments of this present work identified that repeated exposition to low radiation doses induced strong impairment in adult neurogenesis. Formation of new neurons was nota-bly restricted and the proportion of glial cells was affected, both of which can lead to reduced synaptic plasticity and thereby to cognitive impairment. These results illustrate the relevance of low dose exposed tissue analysis to determine potential side effects of radiotherapy and to possibly reduce them. As juvenile patients show more pronounced side effects and longer life expectancy, all efforts should be made to treat the hippocampus with maximum care.