Maturation, acidification and fusion of cytotoxic granules in primary CD8+ T lymphocytes

Abstract

Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) play an important role in the immune system our body. Their main effector function is to get virally infected and to recognize and kill tumor-like target cells. They contain cytotoxic Substances like Granzyme and Perforin in special secretory vesicles that called cytotoxic granules (CGs) and caused by exocytosis at the the contact point between the CTL and the target cell, called the immune synapse (IS) be released. We examined how the pH regulation in CGs affects the Function of primary mouse CD8 + T cells. We identified the a3 Vacuolar ATPase subunit as an important candidate for the Acidification of CGs is responsible. Using a newly generated Using a CG-specific pH indicator, we determined the pH of CGs to be 6.11 ± 0.2. The knockdown of the a3 subunit increased the pH in CGs to 6.8 and resulted in a significantly reduced killing of p815 target cells. Furthermore we examined CG secretion using TIRF microscopy. The reduction the a3 subunit in mouse CTLs showed a 75% reduction in CG secretion, caused by a faulty transport of the CGs to the IS has been. We have shown by electron microscopic examinations that the a3 knockdown in CTLs leaves the biogenesis of CGs unchanged. Out we include our high-resolution microscopic TIRF and STED data, that the a3 subunit of the vATPase is not only used for the acidification of CGs responsible, but also contributes to the efficient transport of the CGs to the IS. In addition, we expanded our study to include the vesicular Identify components of CGs involved in the merger. The Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis (FHL) is a genetic one Disease caused by mutations in many genes that are present in Plasma membrane fusion machines work. Identified in this study we use VAMP7 as an essential part of the vesicular Fusion machinery of primary human CD8 + T cells. A SIM microscopic analysis different VAMP isoforms showed that only VAMP7 is localized together with granule markers (Granzym B and Perforin) and at the same time fused with them at IS. Furthermore, the Downregulation of VAMP7 protein expression increases the killing efficiency of T cells significant when incubated with RAJI target cells. Interestingly enough VAMP7 did not interfere with the early signaling of T cell receptors. Biochemical assays showed that VAMP7 functions in a SNARE complex with Syntaxin11 and SNAP-23 on the plasma membrane. The Overexpression of the VAMP7 longin domain in CTLs inhibits the fusion of CGs specifically without affecting the fusion of recycling endosomes. Our Data identify the essential components of the fusion machinery in T cells. This knowledge could be a starting point for development potential drugs in immunotherapy that target those for VAMP7 target specific Longin domain.

Zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) spielen eine wichtige Rolle im Immunsystem unseres Körpers. Ihre hauptsächliche Effektorfunktion besteht darin, viral infizierte und tumorartige Zielzellen zu erkennen und abzutöten. Sie enthalten zytotoxische Substanzen wie Granzyme und Perforin in speziellen sekretorischen Vesikeln, die als zytotoxische Granula (CGs) bezeichnet werden und durch Exozytose an der als Immunsynapse (IS) bezeichneten Kontaktstelle von CTL und Zielzelle freigesetzt werden. Wir untersuchten, wie sich die pH-Regulierung in CGs auf die Funktion der primären Maus-CD8+-T-Zellen auswirkt. Wir identifizierten die a3- Untereinheit der vakuolären ATPase als einen wichtigen Kandidaten, der für die Ansäuerung von CGs verantwortlich ist. Unter Verwendung eines neu generierten CG-spezifischen pH-Indikators bestimmten wir den pH-Wert von CGs mit 6,11 ± 0,2. Der Knockdown der a3-Untereinheit erhöhte den pH-Wert in CGs auf 6,8 und führte zu einer signifikant verringerten Abtötung von p815-Zielzellen. Außerdem untersuchten wir die CG-Sekretion mit Hilfe der TIRF-Mikroskopie. Die Reduktion der a3-Untereinheit in Maus-CTLs ergab eine 75%ige Verringerung der CGSekretion, die durch einen fehlerhaften Transport der CGs zur IS verursacht wurde. Wir haben durch elektronenmikroskopische Untersuchungen gezeigt, dass der a3-Knockdown in CTLs die Biogenese von CGs unverändert lässt. Aus unseren hochauflösenden mikroskopischen TIRF- und STED-Daten schließen wir, dass die a3-Untereinheit der vATPase nicht nur für die Ansäuerung von CGs verantwortlich ist, sondern auch zum effizienten Transport der CGs zur IS beiträgt. Darüber hinaus haben wir unsere Studie erweitert, um die vesikulären Komponenten von CGs zu identifizieren, die an der Fusion beteiligt sind. Die familiäre hämophagozytäre Lymphohistiozytose (FHL) ist eine genetisch bedingte Erkrankung, die durch Mutationen vieler Gene verursacht wird, die in Plasmamembran-Fusionsmaschinen funktionieren. In dieser Studie identifizierten wir VAMP7 als einen wesentlichen Bestandteil der vesikulären Fusionsmaschinerie von primären humanen CD8+T-Zellen. Eine SIMMikroskopieanalyse verschiedener VAMP-Isoformen zeigte, dass nur VAMP7 zusammen mit Granulamarkern (Granzym B und Perforin) lokalisiert ist und gleichzeitig mit ihnen an der IS fusioniert. Ferner verringerte die Herunterregulierung der VAMP7-Proteinexpression die Abtötungseffizienz von TZellen bei Inkubation mit RAJI-Zielzellen signifikant. Interessanterweise interferierte VAMP7 nicht mit der frühen Signalgebung von T-Zellrezeptoren. Biochemische Assays zeigten, dass VAMP7 seine Funktion in einem SNAREKomplex mit Syntaxin11 und SNAP-23 an der Plasmamembran ausübt. Die Überexpression der VAMP7-Longin-Domäne in CTLs hemmt die Fusion von CGs spezifisch, ohne die Fusion von Recycling-Endosomen zu beeinträchtigen. Unsere Daten identifizieren die essentiellen Komponenten der Fusionsmaschinerie in T- Zellen. Diese Kenntnisse könnten einen Ausgangspunkt für die Entwicklung potenzieller Medikamente in der Immuntherapie darstellen, die auf die für VAMP7 spezifische Longin-Domäne abzielen.