Eine Mutation des Myosin-bindenden Protein C bei der hypertrophen Kardiomyopathie induziert mitochondriales H2O2 durch ein Ungleichgewicht zwischen ADP-induzierter Oxidation und Ca2+-induzierter Regeneration von NADPH

Abstract

1.1 Myosin binding protein C mutation in hypertrophic cardiomyopathy provokes mitochondrial H2O2 by a mismatch between ADP-induced oxidation and Ca2+-induced regeneration of NADPH Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most common inherited cardiac disease and is frequently caused by mutations in sarcomeric proteins, in particular of the cardiac myosinbinding protein C (Mybpc3). Many mutations have in common that they increase myofilament Ca2+ sensitivity, typically inducing diastolic dysfunction. While Ca2+ sensitization of the myofilaments explains diastolic dysfunction, it is incompletely resolved how these mutations induce cardiac hypertrophy and arrhythmias. Reactive oxygen species (ROS) are involved in the pathophysiology of hypertrophy and arrhythmias, and an important ROS source are mitochondria. Elimination of H2O2 (but not .O2-) in mitochondria is governed by enzymes that require NADPH, which is in equilibrium with NADH and regenerated by the Krebs cycle. Here, we show that HCM mutations that increase myofilament Ca2+ sensitivity generate bioenergetic mismatch and oxidative stress during β-adrenergic stimulation. An elevation of work per se induces oxidation of NAD(P)H, since ADP accelerates the donation of electrons to the ETC by NADH. Physiological elevations of cardiac work are mediated by b-adrenergic stimulation, which increases cytosolic Ca2+ ([Ca2+]c) transients and mitochondrial Ca2+ ([Ca2+]m) accumulation. Elevated [Ca2+]m stimulates the Krebs cycle, accelerating NAD(P)H regeneration to equilibrate its redox state. Since myofilament Ca2+ hypersensitivity, as seen in HCM, induces contraction (and thus, work) at lower [Ca2+]c, we hypothesized that this creates an imbalance between ADP-induced oxidation and Ca2+- dependent regeneration of NAD(P)H, favoring mitochondrial H2O2 emission. The ensuing overflow of ROS from mitochondria then causes arrhythmias. For any given sarcomere shortening that produces work and consumes ATP, less Ca2+ stimulates the Krebs cycle to maintain mitochondrial NADH. This mismatch reverses the mitochondrial transhydrogenase (NNT) to regenerate NADH from NADPH, supporting ATP production at the cost of NADPH-dependent antioxidative capacity.Cardiac myocytes were isolated from a Mybpc3-targeted Knock-In mouse model (KI) carrying a point mutation frequently associated with HCM and increased myofilament Ca2+ sensitivity, and wild-type littermates (WT). Myocytes were exposed to a protocol that simulates a physiological increase in workload by applying the b-adrenergic agonist isoprenaline (10 nM) and increasing the (electrical field-) stimulation frequency from 0.5 to 5 Hz for 1 min (Iso/5Hz). During this protocol, the redox states of NAD(P)H/NAD(P)+ and FADH2/FAD were determined within the same cells by their autofluorescences, respectively (WT, n=25; KI, n=20). Furthermore, fluorescence of the superoxide (.O2-) indicator MitoSOX (n=24/25) or the H2O2 indicator DCF (n=43/25) were monitored, and sarcomere length/shortening was recorded. Finally, [Ca2+]c and [Ca2+]m were monitored simultaneously by a patch-clamp based protocol (performed by Dr. M. Kohlhaas) with similar conditions (n=14/9). As predicted by increased myofilament Ca2+ sensitivity, diastolic sarcomere length was shorter in KI compared to WT myocytes, and after iso/5Hz, systolic sarcomere shortening increased more in KI than in WT (p<0.0001, respectively). In contrast, no differences in diastolic and systolic [Ca2+]c and [Ca2+]m nor in the efficacy of mitochondrial Ca2+ uptake were observed, as indicated by the ratio of [Ca2+]m/[Ca2+]c. Redox states of NAD(P)H/NAD(P)+ and FADH2/FAD were slightly more oxidized at baseline in KI vs. WT myocytes, which was aggravated after Iso/5Hz (p<0.05). While mitochondrial .O2- formation was similar, H2O2 emission increased in KI compared to WT myocytes during redox state oxidations in response to Iso/5Hz (p<0.05). In contrast to WT myocytes, KI myocytes did not survive an extended 3-min protocol of Iso/5Hz. In conclusion, we discovered a novel mechanism by which increased Ca2+ sensitivity of myofilaments in HCM induces mitochondrial ROS emission during b-adrenergic stimulation by a mismatch between ADP-induced oxidation and Ca2+-induced regeneration of the mitochondrial redox state. This mechanism may play an important pathophysiological role for the development of hypertrophy and arrhythmias in HCM.

1.2 Eine Mutation des Myosin-bindenen Proteins C bei der hypertrophen Kardiomyopathie provoziert mitochondriales H2O2 durch ein Ungleichgewicht zwischen ADP-induzierter Oxidation und Ca2+-induzierter Regeneration von NADPH Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist die häufigste hereditäre Herzerkrankung und wird meistens durch Mutationen in den für die Sarkomerproteine kodierenden Genen verursacht, insbesondere des Myosin-bindenden Proteins C (Mybpc3). Während vermehrte Ca2+-Sensitivität der Myofilamente die diastolische Dysfunktion erklärt, ist es allerdings unvollständig geklärt, wie diese Mutationen kardiale Hypertrophie und Arrhythmien induzieren. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind in die Pathophysiologie der Hypertrophie und Arrhythmien involviert, und Mitochondrien sind die Hauptquelle von ROS. Die Eliminierung von H2O2 (aber nicht ·O2-) in Mitochondrien wird durch Enzyme reguliert, die NADPH benötigen, welches im Gleichgewicht mit NADH steht und durch den Citratzyklus regeneriert wird. Hier zeigen wir, dass HCM Mutationen, die die myofilamentäre Ca2+- Sensitivität erhöhen, bioenergetisches Ungleichgewicht und oxidativen Stress während einer β-adrenergen Stimulation erzeugen. Eine Erhöhung der Arbeitslast per se induziert die Oxidation von NAD(P)H, da ADP die Abgabe von Elektronen an die Atmungskette fördert. Eine physiologische Erhöhung der kardialen Arbeit wird durch β-adrenerge Stimulation vermittelt, die die zytosolischen Ca2+ ([Ca2+]c) Transienten und mitochondriale Ca2+ ([Ca2+]m) Akkumulation erhöht. Gesteigertes [Ca2+]m stimuliert den Citratzyklus und beschleunigt die NAD(P)H Regeneration, um den Redox-Status auszugleichen. Die bei HCM erhöhte myofilamentäre Ca2+-Sensitivität führt zu einer verstärkten Kontraktion und damit Arbeit bei niedrigeren oder gleichen [Ca2+]c. Folglich spekulierten wir, dass dieser Umstand ein Ungleichgewicht zwischen ADP-induzierter Oxidation und Ca2+-abhängiger Regeneration von NAD(P)H enstehen lässt, welches die mitochondriale H2O2 Emission begünstigt. Die darauffolgende mitochondriale Überproduktion von ROS könnte dann kardiale Arrhythmien verursachen. In Folge jeder einzelner Sarkomerverkürzung, die Arbeit produziert und ATP verbraucht, stimuliert weniger Ca2+ den Citratzyklus, um NADH zu regenerieren. Dieses Ungleichgewicht dreht die Reaktionsrichtung der mitochondrialen Transhydrogenase (NNT) um, mit dem Ziel, das benötigte NADH aus NADPH zu regenerieren - die ATP-Produktion wird somit auf Kosten der antioxidativen Kapazität gefördert. Kardiale Myozyten wurden aus einem Mausmodel mit genetischem Knock-In (KI) einer beim Menschen vorkommenden Mutation des Mybpc3 Gens isoliert, die eine gesteigerte Ca2+- Sensitivität der Myofilamente verursacht. Als Kontrolle dienten gleichaltrige Wildtyp- Geschwistertiere. Die Myozyten wurden einem Protokoll ausgesetzt, das einen physiologischen Arbeitslastanstieg durch Anwendung des β-adrenergen Agonisten Isoprenalin (10 nM) und Zunahme der elektrischen Feldstimulationsfrequenz von 0,5 auf 5 Hz für eine Minute simulierte (Iso/5Hz). Während dieses Protokolls wurde der mitochondriale Redoxstatus von NAD(P)H/NAD(P)+ und FADH2/FAD anhand der entsprechenden Autofluoreszenzen aufgezeichnet (WT, n=25; KI, n=20). Darüber hinaus wurde die Fluoreszenz des Superoxid (.O2-)-Indikators MitoSOX (n=24/25) und des H2O2-Indikators DCF (n=43/25) beobachtet und darüber hinaus die Länge und die Verkürzung der Sarkomere aufgezeichnet. Am Ende wurden [Ca2+]c and [Ca2+]m gleichzeitig anhand eines Patch-Clampbasierten Protokolls unter ähnlichen Voraussetzungen aufgezeichnet (durch Dr. M. Kohlhaas; n=14/9). Bedingt durch die erhöhte Ca2+-Sensitivität der Myofilamente war die diastolische Sarkomerlänge kürzer bei den KI im Vergleich zu den Wildtyp Myozten. Nach Iso/5Hz nahm die Sarkomerverkürzung der KI stärker zu als die der WT (p<0.0001). Im Gegensatz hierzu wurden weder Unterschiede zwischen diastolischem und systolischem [Ca2+]c und [Ca2+]m, noch in der Wirksamkeit der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme festgestellt, abgebildet in dem Verhältnis von [Ca2+]c und [Ca2+]m. Der mitochondriale Redoxstatus von NAD(P)H/NAD(P)+ und FADH2/FAD war zu Beginn leicht oxidierter bei den KI verglichen mit den WT Myozyten, was sich nach Iso/5Hz weiter verstärkte (p<0.05). Im Gegensatz zu den WT Myozyten überlebten die KI Myozten kein verlängertes 3-Minuten Protokoll von Iso/5Hz. Zusammenfassend haben wir einen neuen Mechanismus entdeckt, bei dem durch die gesteigerte Ca2+-Sensibilität der Myofilamente bei HCM mitochondriale ROS-Produktion während β-adrenerger Stimulation induziert wird. Dies geschieht durch ein Ungleichgewicht zwischen ADP-induzierter Oxidation und Ca2+-induzierter Regeneration des mitochondrialen Redoxstatus. Dieser Mechanismus könnte eine wichtige pathophysiologische Rolle in der Entstehung von Hypertrophie und Arrhythmien bei der HCM spielen.