Funktionelle Charakterisierung der SUMOylierung des Nukleoporins Nup2 in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Nup2 ist ein Nukleoporin der Hefe, welches sich zusammen mit Nup60 und Nup1 an der Kernseite des Kernporenkomplexes befindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde vorwiegend die Rolle der SUMOylierung von Nup2 untersucht. Zuvor wurden die Lysinreste an Position 153 und 170 in vitro als SUMOylierungsstellen identifiziert. In dieser Arbeit wurden weiter gehende SUMOylierungsstudien mit Nup2 durchgeführt. Weiterhin wurden Effekte der nicht SUMOylierbaren Mutante (Nup2 K153R/K170R) in vivo analysiert. Es zeigte sich, dass die SUMOylierung keinen Einfluss auf die Lokalisierung von Nup2 selbst sowie auf die Stabilität des Bindepartners Nup60 hat und dass auch der klassische Kernimport von NLS-Proteinen nicht beeinträchtigt ist. Unter Verwendung des LacI/LacO-Systems wurde nachgewiesen, dass die SUMOylierung von Nup2 keinen gravierenden Einfluss auf die Genaktivierung und Genlokalisation (der Gene INO1 und GAL1) hat, auch wenn ein Mitwirken von Nup2 diesen Mechanismus betreffend zuvor beschrieben wurde. Nup2 ist in vivo normalerweise nur schwach SUMOyliert, aber bei osmotischem Stress steigt die SUMOylierung dramatisch an. Das trifft ebenfalls auf Nup60 zu. Beide Nukleoporine spielen offenbar eine Rolle beim Osmostress (nicht aber bei Alkoholstress). Es wurde weiterhin eine Ubiquitinierung von Nup2 detektiert und der Einfluss der SUMOylierung auf die Ubiquitinierung analysiert. Nach osmotischem Stress zeigt sich in der Nup2-SUMO-Mutante eine klar verringerte Ubiquitinierung. Somit gibt es offenbar ein Zusammenspiel der Modifikationen durch SUMO und Ubiquitin bei der Stressantwort. Es wurde außerdem gefunden, dass von den drei relevanten SUMO E3-Ligasen hauptsächlich Siz1 und Nfi1 zusammen und nicht nur eine spezielle E3 allein für die SUMOylierung notwendig ist. Die weitere funktionelle Analyse der SUMOylierung von Nup2 bestand in der Untersuchung der Osmoadaption. Ein Einfluss der SUMOylierung von Nup2 auf das Zellwachstum wurde nicht gefunden. Die Lokalisation von Nup2 am NPC ist nach osmotischem Stress unverändert. Die SUMO-spezifische Reaktion auf Stress in Form von osmotischem Schock, welche in einer verstärkten SUMOylierung von Nup2 resultiert, wurde sowohl in Δhog1, Δulp2 sowie nup60-SUMO-KR Zellen im Vergleich zum Wildtyp verstärkt detektiert, während Δnup60 und ulp1-133 Mutanten bereits eine stärkere GrundSUMOylierung zeigen. Die SUMO-Dekonjugasen Ulp1 und Ulp2 unterscheiden sich in ihrer deSUMOylierenden Funktion. Während Ulp1 konstant deSUMOyliert, wird Ulp2 infolge der SUMO-spezifischen Stressantwort verstärkt aktiv. Dadurch ergeben sich Anhaltspunkte für weitere Untersuchungen zur Funktion der SUMOylierung von Nup2. Um weitere, potentiell SUMO-abhängige Interaktionspartner von Nup2 zu identifizieren, wurden Co-Immunpräzipitationen durchgeführt und die Eluate massenspektrometrisch analysiert. Es wurden einige bereits bekannte Interaktionspartner bestätigt und mit der E3-Ubiquitinligase Bre1 ein neuer potentiell SUMO-abhängiger Interaktionspartner identifiziert. Andere Interaktionspartner deuten auf weitere Funktionen von Nup2 hin. Das betrifft das Targeting von Transposons, bei dem neben Nup2 und Nup60 auch SUMOylierung eine Rolle spielt. Schließlich existiert ein potentieller Einfluss der SUMOylierung von Nup2 auf die Meiose diploider Zellen, da die für die Meiose relevante Sequenz von Nup2 beide SUMOylierungsstellen beinhaltet.

Nup2 is a yeast nucleoporin which is localized along with Nup60 and Nup1 on the nuclear side of the nuclear pore complex. This work focused on the investigation of the role of Nup2 SUMOylation. Previously, the lysine residues at position 153 and 170 were identified as SUMOylation sites in vitro. In this work, further SUMOylation studies with Nup2 were performed. Furthermore, effects of the non-SUMOylatable mutant (Nup2 K153R / K170R) were analyzed in vivo. It was shown that SUMOylation does not affect the localization of Nup2 itself and the stability of the binding partner Nup60. Also the classical nuclear import of NLS proteins is not compromised. Using the LacI/LacO system, it was demonstrated that the Nup2 SUMOylation has no significant effect on gene activation and gene localization (of the INO1 and GAL1 genes), although the involvement of Nup2 in this mechanism was described previously. Under normal conditions, the SUMOylation of Nup2 is weak in vivo, but it increases dramatically after osmotic stress, which also applies to Nup60. Thus, both nucleoporins appear to play a role in osmostress (but not in alcohol stress). Furthermore, it was found that Nup2 is also ubiquitylated and the influence of SUMOylation on ubiquitylation was analyzed. After osmotic stress, the Nup2-SUMO mutant shows a clearly reduced ubiquitylation. Thus, there seems to be an interaction of the modifications by SUMO and ubiquitin in the stress response. It was also found that among the three relevant SUMO E3 ligases, mainly Siz1 and Nfi1 together, but not just one specific E3 alone, are needed for SUMOylation. Further functional analysis of the SUMOylation of Nup2 focused on osmoadaption. No effect of Nup2 SUMOylation on cell growth was found. The localization of Nup2 at the NPC is unchanged upon osmotic stress. The SUMO-specific stress response after osmotic shock resulting in an increased SUMOylation of Nup2 is strongly increased in Δhog1, Δulp2, and nup60-SUMO-KR cells compared to the wild-type. On the other hand, Δnup60 and ulp1-133 mutants already show a stronger basic SUMOylation. The SUMO deconjugases Ulp1 and Ulp2 differ in their deSUMOylation function. While deSUMOylation by Ulp1 is a constant process, the activity of Ulp2 increases as a result of the SUMO-specific stress response. This provides new options for further studies on the function of Nup2 SUMOylation. To identify novel potentially SUMO-dependent Nup2 interaction partners, co-immunoprecipitations were performed, and the eluates were analyzed by mass spectrometry. Several already known interaction partners were confirmed and a new potentially SUMO-dependent interaction partner, the E3 ubiquitin ligase Bre1, was identified. Other interaction partners point to additional functions of Nup2, for example the targeting of transposons, in which besides Nup2 and Nup60 also SUMOylation plays a role. Finally, there is a potential effect of Nup2 SUMOylation on the meiosis of diploid cells, since the meiosis-relevant sequence of Nup2 contains both SUMOylation sites.