The function of Synaptotagmin 7 in mouse cytotoxic T lymphocytes

Abstract

Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) kill tumor cells and virus-infected cells by secreting lytic components like perforin and granzymes contained in cytotoxic granules (CGs). Exocytosis of cytotoxic granules is calcium-dependent and might be regulated by synaptotagmins. Synaptotagmin 7 (Syt7) is a calcium-dependent isoform of synaptotagmins which has been shown to regulate multiple functions in different types of tissues. Its ubiquitous expression and extremely high calcium sensitivity made it to be further investigated as the candidate calcium sensor for cytotoxic granule exocytosis. We determined the expression profile of the synaptotagmin family in mouse CTLs; four isoforms are expressed: Syt2, Syt7, Syt11, and Syt16; only Syt2 and Syt7 are calcium-dependent. Since cytotoxic granules are lysosome-related organelles, and Syt7 has been shown to regulate lysosomal exocytosis as well as to influence killing in T cells, we studied the function of Syt7 in CTLs. We found that Syt7 is localized on cytotoxic granules and on the plasma membrane. We compared GranzymeB-mCherry secretion in WT and Syt7 KO cells at low and high (10 mM) extracellular calcium and we found that Syt7 is not required for early CG fusion at low calcium however its absence abolishes regenerated secretion at high calcium. Overexpression of WT Syt7 in Syt7 KO cells rescued secretion at high calcium. Expression of Syt7 mutants which lack the calcium binding aspartate residues in the C2A domain of Syt7 produced limited CG fusion at high calcium. We checked the availability of granules at the synapse and we found that granule counts were compromised in cells lacking Syt7 or expressing mutated Syt7. Yet, differences in granule numbers were modest and do not account to the lack of secretion at high calcium. Hence, we think that Syt7 promotes granule replenishment at the synapse in response to elevated calcium and regulates their fusion. By comparing the fusion kinetics in WT and Syt7 KO cells, we found that Syt7 prolongs and stabilizes fusion pore openings. To examine the role of Syt2 in CTLs, we downregulated its expression by siRNA. This resulted in reduced probability of secretion to comparable levels of protein downregulation. According to our results, we propose Syt2 as a major regulator of CG fusion in mouse CTLs, and Syt7 as a regulator of regenerated secretion under elevated calcium conditions.

Zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) töten Tumorzellen und virusinfizierte Zellen, indem sie lytische Komponenten wie Perforin und Granzyme, die in zytotoxischen Granulaten (CGs) enthalten sind, absondern. Die Exozytose von zytotoxischen Granulaten ist calciumabhängig und kann durch Synaptotagmine reguliert werden. Synaptotagmin 7 (Syt7) ist eine kalziumabhängige Isoform von Synaptotagminen, die nachweislich mehrere Funktionen in verschiedenen Gewebearten reguliert. Aufgrund seiner allgegenwärtigen Expression und seiner extrem hohen Kalziumempfindlichkeit wurde er als geeigneter Kalziumsensor für die zytotoxische Granulatexozytose weiter untersucht. Wir haben das Expressionsprofil der Synaptotagminfamilie in Maus-CTLs bestimmt; vier Isoformen werden exprimiert: Syt2, Syt7, Syt11 und Syt16; nur Syt2 und Syt7 sind calciumabhängig. Da zytotoxische Granulate lysosomenbezogene Organellen sind und Syt7 nachweislich die lysosomale Exozytose reguliert und das Töten in T-Zellen beeinflusst, haben wir die Funktion von Syt7 in CTLs untersucht. Wir fanden heraus, dass Syt7 auf zytotoxischen Granulaten und auf der Plasmamembran lokalisiert ist. Wir verglichen GranzymeB-mCherry-Sekretion in WT- und Syt7-KO-Zellen bei niedrigem und hohem (10 mM) extrazellulärem Kalzium und wir fanden heraus, dass Syt7 nicht für die frühe CG-Fusion bei niedrigem Kalziumgehalt erforderlich ist, aber seine Abwesenheit beseitigt regeneriertes Sekret bei hohem Kalziumgehalt. Die Überexpression von WT Syt7 in Syt7 KO-Zellen rettete das Sekret bei hohem Kalziumgehalt. Die Expression von Syt7-Mutanten, denen die calciumbindenden Aspartatreste in der C2A-Domäne von Syt7 fehlen, führte zu einer begrenzten CG-Fusion bei hohem Calciumgehalt. Wir überprüften die Verfügbarkeit von Granulaten an der Synapse und fanden heraus, dass die Granulatzahl in Zellen ohne Syt7 oder mit mutiertem Syt7 beeinträchtigt war. Die Unterschiede in der Granulatzahl waren jedoch bescheiden und erklären nicht den Mangel an Sekretion bei hohem Kalziumgehalt. Daher denken wir, dass Syt7 die Granulatauffüllung an der Synapse als Reaktion auf erhöhtes Kalzium fördert und deren Fusion reguliert. Durch den Vergleich der Fusionskinetik in WTund Syt7-KO-Zellen fanden wir heraus, dass Syt7 die Porenöffnungen der Fusion verlängert und stabilisiert. Um die Rolle von Syt2 in CTLs zu untersuchen, haben wir seine Expression durch siRNA heruntergeregelt. Dies führte zu einer reduzierten Wahrscheinlichkeit der Sekretion auf ein vergleichbares Niveau der Protein-Downregulation. Gemäß unseren Ergebnissen schlagen wir Syt2 als Hauptregulator der CG-Fusion in Maus-CTLs und Syt7 als Regulator der regenerierten Sekretion unter erhöhten Kalziumbedingungen vor.