Exogenes Melatonin führt zur Modifikation der zellulären Stressantwort in der Leber nach polymikrobieller Sepsis in der Maus

Abstract

Die Sepsis ist aufgrund ihrer Häufigkeit und hohen Mortalität ein Krankheitsbild mit herausragender klinischer Bedeutung. Neben der Sanierung des Infektfokus und einer antibiotischen Therapie beschränken sich die aktuell verfügbaren Therapiemöglichkeiten auf eine Stabilisierung des Patienten und die Behandlung der sich entwickelnden Organfehlfunktionen. Eine spezifische supportive Therapie konnte bisher, trotz vielfacher wissenschaftlicher Bemühungen, noch nicht etabliert werden. Die Komplexität der pathophysiologischen Zusammenhänge des Krankheitsbildes erschwert die Identifizierung von Therapiemechanismen. Einen möglichen Ansatzpunkt stellt oxidativer Stress dar. In vorangegangenen experimentellen und vereinzelten klinischen Untersuchungen konnte ein positiver Effekt von Melatonin auf das Redoxgleichgewicht belegt werden. Unserer Arbeitsgruppe war es zudem möglich eine dosisabhängige Lebensverlängerung während einer polymikrobiellen Sepsis in der Maus durch Melatonin zu zeigen. Wie dieser Effekt vermittelt wird, ist bisher nicht abschließend geklärt. Weitere Bereiche der zellulären Stressantwort müssen in Betracht gezogen werden. Hierzu gehören die Mechanismen der Zelle als Reaktion auf den vermehrten Anfall fehlgefalteter Proteine im Endoplasmatischen Retikulum, welche als Unfolded Protein Response bezeichnet werden. Verbindungen zur Sepsis sind beschrieben, der Einfluss von Melatonin ist jedoch weitgehend unklar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkungen von Melatonin auf Marker für oxidativen Stress und Unfolded Protein Response zu evaluieren und mögliche Verbindungen aufzudecken. Zu diesem Zweck wurden männliche C3H / HeN Mäuse einer Scheinoperation unterzogen oder durch Coecum Ligation und Inzision eine polymikrobielle Sepsis induziert. Es wurde Melatonin in einer Dosis von 1 mg / kg / Körpergewicht oder Vehikellösung injiziert und nach 5 Stunden in Narkose die Organe der Tiere entnommen. Der Gehalt an Superoxid in Aorta, Leber und Milz wurde mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie bestimmt. Protein- und mRNA-Expression verschiedener Marker der zellulären Stressantwort in der Leber wurden respektive mit Western Blot und quantitativer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion bestimmt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Sepsis zu einem durch Melatonin reversiblen Anstieg der Superoxidkonzentration in Leber und Aorta führt, während sich die in der Milz bereits basal erhöhten Konzentrationen unbeeinflusst zeigten. Die hepatische Expression der Superoxiddismutase korrelierte nicht mit den veränderten Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies. Melatonin hatte keine Wirkung auf den Expressionsanstieg der Adhäsionsmoleküle vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1 und intrazelluläres Adhäsionsmolekül-1 in der Sepsis. Ein ähnliches Verhalten der Phosphorylierung von extracellular-signal regulated kinases 1 / 2 zu den Adhäsionsmolekülen lässt eine Beteiligung an deren Regulation möglich erscheinen. Ein generell induzierender Effekt der Sepsis auf die Unfolded Protein Response blieb entgegen früherer Beobachtungen aus. Als Erklärung für die heterogene Datenlag kommen abweichende Sepsismodelle und die Untersuchung unterschiedlicher Organe bzw. Zelllinien in Betracht. Melatonin führte im angewandten Versuchsaufbau in der Leber septischer Mäuse zu einer Aktivierung der protein kinase ribonucleic acid-like endoplasmic reticulum kinase und des nachgeschalteten CCAAT / enhancer-binding-protein homologous protein. Dieser Signalweg stellt über den Verbrauch von Redoxäquivalenten und die Endoplasmatisches Retikulum Oxidase 1 eine mögliche Verbindung zwischen Unfolded Protein Response und oxidativem Stress dar. In der vorliegenden Arbeit konnten Erkenntnisse über die Vermittlung des protektiven Effekts von Melatonin in der Sepsis gewonnen werden. Zudem wurden Anhaltsatzpunkte für weitere Studien generiert und Faktoren identifiziert die hierbei besonderer Berücksichtigung bedürfen.

Sepsis is due to its prevalence and high mortality a disorder with exceptional clinical significance. Apart from removal of the focus of infection and antibiotic treatment therapeutic options are currently limited to stabilizing the patient and compensating the developing organ dysfunction. So far, a specific supportive therapy could not be established despite extensive scientific effort. The complexity of underlying pathophysiology of the disease has hindered identification of therapeutic targets. Oxidative stress poses a possible area of interest in this regard. Previous experimental and a limited number of clinical studies have shown promising results concerning the positive effect of melatonin on redox balance. Our working group was able to show a dose dependent prolongation of survival by melatonin in mice in polymicrobial sepsis. How this was mediated remains to be clarified but other areas of cellular stress response have to be considered apart from oxidative stress. This includes cells mechanisms in coping with an increasing amount of misfolded protein in the endoplasmic reticulum which are summarized under the term unfolded protein response. Relevance of this process in sepsis has been noted but the role of melatonin remains largely unclear. In this study we aimed to elicit the effects of melatonin on common markers of oxidative Stress and the unfolded protein response and identify possible connections. For this male C3H / HeN mice were submitted to sham operation or underwent cecal ligation and incision to induce sepsis under anesthesia. 1 mg / kg bodyweight of melatonin or vehicle solution were administered and after 5 hours the animals’ organs were removed. The concentration of superoxide in aorta, liver and spleen was measured with electron spin resonance. Protein and mRNA expression levels were determined by western blot analysis and quantitative real-time polymerase chain reaction respectively. The results indicate a rise in the superoxide concentration in liver and aorta of septic animals reversible by application of melatonin whereas already initially elevated concentrations in the spleen remained unchanged. No correlation between hepatic expression of superoxide dismutase and concentration on reactive oxygen species was seen. Melatonin did not influence the rise in expression of adhesion molecules vascular cell adhesion molecule-1 and intracellular cellular adhesion molecule-1caused by sepsis. A similar behavior of the phosphorylation of extracellular-signal regulated kinases 1 / 2 to changes in protein expression lets involvement in regulation of these adhesion molecules seem possible. An inducing effect of sepsis on the unfolded protein response in general could not be shown contrary to previous observations. The Zusammenfassung/Summary 6 heterogenicity of data might be caused by varying sepsis models and differences in examined cell lines or organs. Melatonin in this experimental set up led to activation of protein kinase ribonucleic acid-like endoplasmic reticulum kinase and the downstream CCAAT / enhancer-binding-protein homologous protein in the liver of septic mice. This signaling pathway poses a possible connection between oxidative stress and unfolded protein response by reduction in consumption of redox equivalents and involvement of endoplasmic reticulum oxidase 1. The presented study was able to gather evidence on the mediation of the protective effects of melatonin in sepsis. Further objectives for subsequent studies were generated along with factors which thereby demand special consideration.