Funktionelle Charakterisierung des humanen Translokon-assoziierten Protein Komplexes

Abstract

Das humane Proteom umfasst zu etwa einem Drittel solche Proteine, welche über den sekretorischen Weg prozessiert und modifiziert werden, bevor sie anschließend an ihren Funktionsort gelangen. Der Transport der synthetisierten Polypeptide wird über den heterotrimeren Sec61-Komplex vermittelt. Je nach Eigenschaften der Substrate sind dabei akzessorische Komponenten nötig, die den Import unterstützen. Eine dieser Komponenten ist der Translokon-assoziierte Protein (TRAP) Komplex, dessen Struktur jüngst mittels Cryo-Elektronentomografie (CET) näher charakterisiert wurde. Auf funktioneller Ebene waren die Eigenschaften des TRAP-Komplexes bis dato jedoch weitestgehend unverstanden. Mutationen der Untereinheiten des TRAP-Komplexes führten zur Ausprägung einer congenitalen Glykosylierungskrankheit („congenital disorder of glycosylation“, CDG), deren Manifestation mechanistisch unverstanden ist. Zur funktionellen Charakterisierung des TRAP-Komplexes, seiner Substrate und deren Eigenschaften sowie der Erstellung eines mechanistischen Modells wurden markierungsfreie massenspektrometrische Analysen durchgeführt. Sowohl Fibroblasten der CDG-Patienten als auch mittels RNA-Interferenz (RNAi) TRAP-depletierte HeLa-Zellen wurden hinsichtlich Veränderungen des Proteoms gegenüber Kontrollzellen analysiert. Durch bioinformatisch gestützte Proteinhäufigkeitsbestimmungen wurden potentielle TRAP-Substrate identifiziert und in unabhängigen Experimenten mittels Western Blot, qRT-PCR und Komplementationsanalysen validiert. Dabei wurde ermittelt, dass die Signalpeptide derer Proteine, die zum Import in das ER-Lumen auf die Anwesenheit des TRAP-Komplexes angewiesen sind, einen erhöhten Anteil helixbrechender Aminosäuren Glycin und Prolin (GP) sowie verminderte Hydrophobizität aufweisen. Diese Substrateigenschaften wurden ebenfalls durch Mutationsanalysen in intakten HeLa-Zellen validiert. Unter Beachtung der Daten der CET-Analysen könnten die Funktionen des TRAP-Komplex folgendermaßen beschrieben werden: Auf cytosolischer Seite der ER-Membran könnte der TRAP-Komplex als Signalpeptidrezeptor agieren, der solche Signalpeptide mit einem erhöhten GP-Gehalt und/oder verminderter Hydrophobizität erkennt. Diese Information könnte innerhalb des Komplexes an luminale Teile weitergeleitet werden, wodurch diese in substratspezifischer Art und Weise die Öffnung der Translokationspore fördern. Die strukturellen Untersuchungen zeigten, dass der TRAP-Komplex in räumlicher Nähe zu Loop 5 von Sec61α steht, worüber eine Interaktion möglich sein könnte.

Functional characterization of the human translocon associated protein complex The human proteome comprises about one-third of proteins, which are processed and modified via the secretory pathway before they subsequently arrive at their functional place of destination. The transport of the synthesized polypeptides is mediated by the heterotrimeric Sec61 complex. Depending on the properties of the substrates, the Sec61 complex needs accessory components that support the import of the proteins. Such an accessory component is the translocon associated protein (TRAP) complex, whose structure has recently been characterized by cryo electron tomography (CET). At the functional level, however, the properties of the TRAP complex have been poorly understood so far. Mutations in the subunits of the TRAP complex result in a loss of whole TRAP complex, which lead to the development of a congenital disorder of glycosylation (CDG), which is mechanistically not understood. Here, siRNA mediated gene knock-down in HeLa cells was combined with label-free quantitative proteomic analysis and differential protein abundance analysis to identify TRAP dependent precursors and to characterize determinants of TRAP substrate specificity. Also, CDG-fibroblasts were analyzed for cellular protein abundance changes upon the loss of TRAP complex. The results were validated in independent experiments by quantitative RT-PCR, western blotting and complementation analysis. The signal peptides of TRAP clients, e.g. proteins that are dependent on TRAP complex for import into the ER lumen, exhibit above-average content of helix-breaking amino acids glycine-plus-proline and below-average hydrophobicity as distinguishing features. These determining substrate properties were validated by mutagenesis studies in intact HeLa cells. Considering the data of the CET analysis, the functions of the TRAP complex could be described as follows: On the cytosolic face of the ER membrane, TRAP complex may act as a signal peptide receptor recognizing precursor polypeptides peptides of high glycine-plus-proline content and/or low hydrophobicity. The transmembrane part of the TRAP complex may serve as an information relay on the luminal side of the ER membrane, thereby triggering opening of the Sec61-channel in a substrate specific manner. Structural studies revealed the TRAP complex in close proximity to the hinge region of Sec61α (loop 5), which may allow interaction.