Immunhistochemische Bestimmung der PD-L1 Expression mit drei verschiedenen Antikörper-Klonen und Bestimmung der SOX10 Expression am triple negativen Mammakarzinom

Abstract

Neue Ansätze mit Checkpoint-Inhibitoren, die gegen Protein Death-Ligand1/Protein Death1 (PD-L1/PD-1) gerichtet sind, zeigen u.a. beim triple negativen Mammakarzinom (TNBC) eine Verbesserung der Therapie. PD-L1 ist in der Zwischenzeit ein etablierter prädiktiver Biomarker bei vielen Tumorentitäten geworden. Zur immunhistochemischen Diagnostik von PD-L1 gibt es eine Vielzahl von Antikörpern und Kits. Ziel dieser Arbeit war es, die PD-L1 Expression am TNBC mit verschiedenen Antikörper-Klonen zu bestimmen, diese Ergebnisse im Hinblick auf die Färbung von Tumorzellmembran, Färbung der Immunzellen und der cytoplasmatischen Färbung zu vergleichen, um herauszufinden, ob die verschiedenen Klone bzw. Methoden ausgetauscht werden können. Zudem sollte überprüft werden, ob eine PD-L1 bzw. SOX10 Expression mit den vorhandenen klinischen Parametern korrelieren. 60 Patientinnen mit TNBC wurden mittels Immunhistochemie auf die Expression von PD-L1 und SOX10 untersucht. Als Detektions-Kit wurde bei den beiden Antikörpern Anti-Human PD-L1 Klon 22C3 von Dako und Klon 28-8 von abcam, sowie bei dem SOX10 Antikörper Klon SP267 von Cell Marque das ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit verwendet. Bei dem Anti-PD-L1 Antikörper Klon SP142 wurde als Detection Kit OptiView DAB IHC verwendet. Von jeder Patientin wurden 3 Stanzen des Tumorgewebes in Tissue-Microarrays eingebracht. Die Schnitte wurden verblindet von zwei unabhängigen Befundern ausgewertet. Für die Auswertung wurden folgende Cut-Offs verwendet: Expression von PD-L1 an der Tumorzellmembran <1% (negativ), >1 bis <50% (positiv) und >50% (stark positiv). Bei der Auswertung von SP142 wurde die Färbung der Immunzellen ausgewertet. Hier wurde als Score der prozentuale Flächenanteil der PD-L1 positiven Immunzellen zu den vorhandenen Tumorzellen verwendet. Patientinnen mit einer PD-L1 Expression von >1 galten als PD-L1 positiv. Bei der immunhistochemischen Färbung von SOX10 wurde die nukleäre Färbung mit folgendem Score ausgewertet: <1 negativ, >1 bis 50, >50 bis >100 und 100. Der Zusammenhang zwischen PD-L1 Expression (TC und IC) und der SOX10 Expression wurden mit den klinischen Parametern der Patientinnen ab Zeitpunkt der Diagnose bis zum Ende der Datenerhebung (Januar 2018) ausgewertet. Insgesamt konnten 59 Patientinnen von 60 ausgewertet werden. In der immunhistochemischen Färbung führten die beiden verwendeten Anti-PD-L1 Antikörper Klon 22C3 und Klon 28-8 in Bezug auf die membranöse Färbung und in Bezug auf die cytoplasmatische Färbung zum gleichen Ergebnis. 12 (20,3%) zeigten mit Klon 22C3 und Klon 28-8 eine positive Membranfärbung mit PD-L1 (Score 1-50%). Bei 1 Patientin (1,7%) konnte eine hohe PD-L1 Expression (Score <50-100) nachgewiesen werden. Die cytoplasmatische Färbung bei der Färbung mit Klon 22C3 und Klon 28-8 war bei 24 Patientinnen (40,7%) positiv, das sind signifikant mehr Patientinnen als bei der Tumorzellmembranfärbung. Bei der Immunzellfärbung mit dem Anti-PD-L1 Antikörper Klon SP142 wurden ebenfalls 24 Patientinnen (40,7%) PD-L1 positiv diagnostiziert (Score >1). Es waren dieselben Patientinnen die auch eine cytoplasmatische Färbung bei der Färbung der Tumorzellmembran mit Klon 22C3 und Klon 28-8 zeigten. Ein niedriger Ki67 Wert unter 30 zeigte einen signifikanten Unterschied zu hohem Ki67 Wert bei der PD-L1 Expression der Tumorzellmembran (Färbung mit Klon 22C3 und Klon 28-8). Bei der PD-L1 Expression der Immunzellfärbung mit Klon SP142 konnte man erkennen, dass die PD-L1 negativen Patientinnen (59,3%) tendenziell einen niedrigeren Ki67 Wert hatten als die PD-L1 positiven Patientinnen (40,7%). Die weiteren klinischen Parameter zeigten keine signifikanten Zusammenhänge zu der PD-L1 Expression (TC und IC) und SOX10 Expression. Die bisher zur immunhistochemischen PD-L1 Bestimmung verwendeten Anti-PD-L1 Antikörper Klon 22C3 und Klon 28-8 führten in dieser Arbeit zum gleichen Ergebnis, so dass beide Antikörper für die immunhistochemische Bestimmung von PD-L1 beim triple negativen Mammakarzinom gleichwertig eingesetzt werden können. Der Klon SP142 kann nicht durch Klon 22C3 und Klon 28-8 ausgetauscht werden, da in dieser Arbeit signifikant mehr PD-L1 positive Patientinnen mit Klon SP142 diagnostiziert wurden. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die zusätzliche Auswertung der cytoplasmatischen Färbung mit Klon 22C3 und Klon 28-8 gleichwertig mit der Immunzellfärbung, gefärbt mit Klon SP142 ist. Daher könnte künftig die cytoplasmatische Färbung mit den beiden Klonen 22C3 und 28-8 an Bedeutung gewinnen. An dem untersuchten Patientinnen Kollektiv konnten wir bis auf Ki67 keinen Zusammenhang zwischen PD-L1, SOX10 und den vorhandenen klinischen Parametern nachweisen.

New approaches with checkpoint inhibitors directed against Protein Death-Ligand1/Protein Death1 (PD-L1/PD-1) show an improvement of therapy in triple negative breast cancer (TNBC). PD-L1 has become an established predictive biomarker in many tumor entities. For the immunohistochemical diagnosis of PD-L1 there are numerous antibodies and kits available. The aim of this work was to determine the expression of PD-L1 at TNBC with different antibody clones, to compare these results with regard to the staining of tumor cell membranes, staining of immune cells and cytoplasmic staining in order to find out whether the different clones or methods can be exchanged. It should also be checked whether PD-L1 or SOX10 expression correlates with the existing clinical parameters. 60 patients with TNBC were examined for the expression of PD-L1 and SOX10 by immunohistochemistry. The detection kit used was the ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit for the two antibodies Anti-Human PD-L1 clone 22C3 from Dako and clone 28-8 from abcam and the SOX10 antibody clone SP267 from Cell Marque. The Anti-PD-L1 antibody clone SP142 was detected with OptiView DAB IHC. From each patient, 3 punches of tumor tissue were inserted into tissue microarrays. The sections were evaluated blinded by two independent observer. The following cut-offs were used for the evaluation: Expression of PD-L1 at the tumor cell membrane <1% (negative), >1 to <50% (positive) and >50% (strongly positive). In the evaluation of SP142 the staining of the immune cells was evaluated. The score was the percentage of PD-L1 positive immune cells to the tumor cells that were present. Patients with a PD-L1 expression of >1 were considered PD-L1 positive. For the immunohistochemical staining of SOX10, the nuclear staining was evaluated with the following score: <1 negative, >1 to 50, >50 to >100 and 100. The relationship between PD-L1 expression (TC and IC) and SOX10 expression was evaluated with the clinical parameters of the patients from the time of diagnosis until the end of data collection (January 2018). A total of 59 patients out of 60 were evaluated. In immunohistochemical staining, the two anti-PD-L1 antibodies used, clone 22C3 and clone 28-8, gave to the same result with respect to membrane staining and cytoplasmic staining. 12 of 59 patients (20,3%) with clone 22C3 and clone 28-8 showed a positive membrane staining with PD-L1 (score 1-50%). In 1 patient (1,7%) a high PD-L1 expression (score <50-100) was detected. The cytoplasmic staining with clone 22C3 and clone 28-8 was positive in 24 patients (40,7%), significantly more patients than with tumor cell membrane staining. In the immune cell staining with the anti-PD-L1 antibody clone SP142 also 24 patients (40,7%) PD-L1 were positively diagnosed (score >1). They were the same patients who also showed cytoplasmic staining of the tumor cell membrane with clone 22C3 and clone 28-8. A low Ki67 value below 30 showed a significant difference to high Ki67 value in PD-L1 expression of tumor cell membrane staining with clone 22C3 and clone 28-8. PD-L1 expression of immune cell staining with clone SP142 showed that PD-L1 negative patients (59,3%) tended to have a lower Ki67 value than PD-L1 positive patients (40,7%). The other clinical parameters showed no significant correlation to PD-L1 expression (TC and IC) and SOX10 expression. The anti-PD-L1 antibodies clone 22C3 and clone 28-8 used so far for the immunohistochemical PD-L1 determination lead to the same result in this study, so that both antibodies could be used equivalently for the immunohistochemical PD-L1 determination in triple negative breast cancer. Clone SP142 cannot be replaced by clone 22C3 and clone 28-8 because significantly more PD-L1 positive patients have been diagnosed with clone SP142. For the first time it could be shown in this study that the additional evaluation of the cytoplasmic staining with clone 22C3 and clone 28-8 is equivalent to the immune cell staining with clone SP142. Therefore, the cytoplasmic staining with the two clones 22C3 and 28-8 could gain importance in the future. With the exception of Ki67, we were unable to demonstrate any correlation between PD-L1, SOX10 and other clinical parameters in the investigated patient group.