DNA molecular recognition specificity : pairwise and in competition

Abstract

Despite its importance in biological systems, the molecular recognition of DNA hybridization within complex, competitive environments is poorly understood. The present thesis investigates DNA hybridization in thermal equilibrium for DNA strands bound to the surface of a microarray as well as in solution in presence of one or more competitors. For the latter we employ fluorescence anisotropy and fluorescence correlation spectroscopy to determine binding affinities of two DNA strands in a pairwise manner and in presence of a single competitor. Our results reveal that there must be a non-trivial interaction between the competing strands that extends beyond simple double helix formation. This is a signature of cooperative behavior, which can lead to more complex binding phenomena than previously thought. Moreover, we find surprising differences between the results of both techniques, which we attribute to differing sensitivities to distinct microstates of double helix formation. The second part of this work is performed with surface-bound DNA and devoted to experimentally determine a sufficient number of differing bases between two sequences to avoid cross-hybridization. We construct a set of 23 non-interacting sequences with a length of 7 bases. We conclude that for systems of increasing complexity a high level of discrimination between many competitors is essential for accurate recognition.

Trotz der Relevanz für biologische Systeme sind die Mechanismen molekularer Erkennung bei der Hybridisierung von DNA in komplexen Umgebungen kaum verstanden. Die vorliegende Arbeit untersucht DNA Hybridisierung im thermischen Gleichgewicht mit DNA-Strängen sowohl an die Oberfläche eines Microarrays gebunden als auch in Lösung in Gegenwart von Konkurrenten. Für letztere verwenden wir Fluoreszenzanisotropie sowie -korrelationsspektroskopie, um Bindungsaffinitäten zweier DNA-Stränge paarweise und in Anwesenheit einzelner Konkurrenten zu bestimmen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es nicht triviale Wechselwirkungen zwischen den beteiligten Strängen geben muss, die über die einfache Bildung einer Doppelhelix hinausgehen. Diese Beobachtung deutet auf kooperatives Verhalten hin und zeigt, dass DNA-Hybridisierung komplexer abläuft als bisher angenommen. Außerdem finden wir eine unerwartete Diskrepanz beider Methoden, die auf unterschiedliche Sensitivitäten für bestimmte Mikrozustände der gebundenen DNA zurückgeht. Im zweiten Teil der Arbeit widmen wir uns Experimenten mit oberflächengebundener DNA. Wir bestimmen eine ausreichende Anzahl sich unterscheidender Basenpaare zweier Stränge, um nicht spezifische Hybridisierung zu vermeiden, und zeigen, dass sich damit ein Satz aus 23 nicht interagierenden Strängen á 7 Basen konstruieren lässt. Wir schließen, dass für zunehmend komplexe Systeme ein hoher Diskriminierungsgrad zwischen vielen Konkurrenten unabdingbar für präzise Erkennung ist.