Inhibition des Enzyms 17β-Hydroxysteroiddehydrogenase Typ 2 : ein neuer Ansatz zur Beeinflussung der Frakturheilung im Mausmodell

Abstract

Die aktuelle Behandlung steroidhormonabhängiger Erkrankungen besteht vorwiegend aus Behandlungsmaßnahmen, welche die Steroidhormonkonzentration nicht nur im Zielorgan, sondern auch in anderem Gewebe und im Plasma verändern. Eine gezieltere Therapie durch Hemmung von Enzymen des intrazellulären Steroidhormonstoffwechsels stellt daher eine attraktive Alternative mit günstigerem Nebenwirkungsprofil dar. Ein wichtiges Enzym dieses intrakrinologischen Stoffwechsels ist die 17β-Hydroxysteroiddehydrogenase Typ 2 (17β-HSD2), welche die Konversion von Östradiol (E2) und Testosteron (T) in ihre biologisch weniger aktiven Ketoformen katalysiert. Eine Blockade der 17β-HSD2 im Knochen führt somit zu einer erhöhten intrazellulären Konzentration von E2 und T. Dadurch kommt es zu einer Hemmung der Knochenresorption und Stimulation der Knochenformation.

Die durchgeführten tierexperimentellen Studien hatten zum Ziel, den Einfluss des 17β-HSD2-Inhibitors AA115 auf die Knochenheilung in der Maus zu untersuchen. Hierfür wurde ein standardisiertes und bereits etabliertes geschlossenes Frakturmodell der Maus heran-gezogen. Als Versuchstiere dienten männliche C57BL/6-Mäuse (n=50). Nach Frakturierung des rechten Femurs und Stabilisierung mit einer intramedullären Zugschraube wurde der Versuchsgruppe (n=25) täglich in einer Vehikellösung gelöstes AA115 in einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht (KG) subkutan appliziert. Die Kontrolltiere (n=25) erhielten ein äquivalentes Volumen Vehikellösung. Zwei, respektive vier Wochen nach Operation und Behandlung mit AA115 oder Vehikellösung wurden die Tiere narkotisiert und getötet. Sowohl das frakturierte, als auch das kontralaterale Femur wurden für biomechanische, radiologische, histologische und proteinbiochemische Analysen explantiert. Für laborchemische Untersuchungen wurde allen Tieren außerdem Blut entnommen.

Die Stabilität des Frakturkallus wurde mittels zerstörungsfreier Drei-Punkt-Biegetestung untersucht. Es wurde die Biegesteifigkeit des frakturierten sowie des kontralateralen Femurs bestimmt. Alle Werte zur Biegesteifigkeit des verheilten Knochens wurden absolut und zusätzlich in Relation zum gesunden Knochen angegeben.

Die radiologische Analyse erfolgte mit Hilfe eines Mikro-Computertomographen. Zur Beurteilung wurden Rekonstruktionen des Frakturkallus angefertigt und das Gesamtvolumen sowie das Knochenvolumen im Gesamtvolumen bestimmt. Darüberhinaus wurden mittlere Anzahl, Breite und Abstand der Knochentrabekel bestimmt. Außerdem erfolgte ein Vergleich der Knochenmineralisation durch Bestimmung der Bone Mineral Density.

Die histologische Beurteilung erfolgte an nach der Masson-Goldner-Trichrome-Methode gefärbten sagittalen, longitudinalen Schnittpräparaten der Knochen. Es wurden die periostale Kallusfläche, sowie die Anteile von Knochen, Knorpel und Bindegewebe innerhalb des periostalen Kallus untersucht.

Zur proteinbiochemischen Untersuchung des Frakturkallus wurden Western Blot Analysen durchgeführt. Im Speziellen wurde zur Beurteilung der Knochenbildung der osteogene Marker Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) bestimmt. Zur Beurteilung der Knochen-resorption wurde die Expression von Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (RANKL) und Osteoprotegerin (OPG) bestimmt. Zusätzlich erfolgte ein semiquantitativer Nachweis des osteo- und angiogenen Wachstumsfaktors Vascular endothelial growth factor (VEGF) im Kallus.

Aus den gewonnenen Blutproben wurde die Konzentration von E2 und T im Plasma ermittelt.

Nach statistischer Auswertung der biomechanischen, radiologischen, histologischen, proteinbiochemischen und laborchemischen Analysen zeigten sich folgende Ergebnisse:

Zwei Wochen postoperativ hatte die Behandlung mit AA115 keinen Einfluss auf die absolute oder relative Biegesteifigkeit der frakturierten Femora. Nach vier Wochen zeigten sich jedoch eine signifikant erhöhte absolute und relative Biegesteifigkeit bei den mit AA115 behandelten Tieren.

Weder die periostale Kallusfläche, noch die Gewebezusammensetzung des periostalen Kallus unterschieden sich nach zwei Wochen. Nach vier Wochen fand sich eine um 61% größere periostale Kallusfläche bei den mit AA115 behandelten Tieren. Im Vergleich zu den Kontrolltieren bestand diese periostale Kallusfläche aus signifikant mehr Knochen, während sich die Anteile von Knorpel und Bindegewebe an der Gesamtfläche nicht unterschieden.

Das Gesamtkallusvolumen und das Knochenvolumen wiesen in der CT-volumetrischen Bestimmung zwei Wochen postoperativ keine Unterschiede zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe auf. Vier Wochen postoperativ zeigte sich jedoch ein tendenziell größeres Kallusvolumen bei den mit AA115 behandelten Tieren. Hinsichtlich ihrer Trabekelstruktur und Knochendichte unterschieden sich die Gruppen weder nach zwei noch nach vier Wochen.

Die Behandlung mit AA115 führte nach zwei Wochen zu einer signifikant erhöhten Expression von OPG. Die übrigen wie oben beschrieben bestimmten Proteine wiesen hinsichtlich ihrer Expression zu diesem Untersuchungszeitpunkt keine Unterschiede zwischen Versuchs- und Kontrollgruppe auf. Nach vier Wochen zeigte sich eine signifikant stärkere Expression von VEGF bei den mit AA115 behandelten Tieren.

Sowohl zwei als auch vier Wochen postoperativ konnte zwischen den Versuchs-gruppen kein Unterschied hinsichtlich der Plasmakonzentration der Hormone E2 und T ermittelt werden.

Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass im Mausmodell durch die Hemmung der 17β-HSD2 die mechanische Stabilität nach Knochenbrüchen durch einen größeren Kallus mit neu gebildetem Knochen deutlich gesteigert wird. Die selektive Blockade der 17β-HSD2 mit AA115 zeigte keinen Einfluss auf die Plasmakonzentration von E2 oder T und birgt daher ein geringes Risiko für systemische Nebenwirkungen.

Therapies of steroid hormone-dependent diseases involve predominantly medication that alters steroid hormone concentrations not only in the target organs but also in non-target tissue and in plasma. A more selective therapy which influences intracellular steroidogenic enzymes represents a promising alternative with much less side-effects. 17β-HSD2 is one important enzyme in this intracrinologic metabolism. It converts estradiol and testosterone into their less active ketones. Blockade of 17β-HSD2 increases intracellular E2 and T in target tissue as bone, and through stimulation of estrogen and testosterone receptor, thus inhibits bone resorption and stimulates bone formation.

The aim of the present study was to investigate the effect of 17β-HSD2 inhibition by AA115, a newly designed agent, on fracture healing in mice. Bone healing was studied in a murine closed femur fracture model. For the present study, male C57BL/6 mice (n=50) were used. After fracture and stabilisation of the femora with an intramedullary screw, 25 mice were treated daily with 50 mg/kg body weight AA115 administered subcutaneously in a vehicle solution. Another 25 vehicle-treated animals served as controls. After two, respectively four weeks observation period the animals were anaesthetised and sacrificed. The fractured femur and the contralateral femur were resected for further biomechanical, radiological, histological and Western blot analysis. In addition, blood samples were taken for plasma analysis.

The callus stiffness was analysed non-destructively with a three-point bending device. The bending stiffness of the fractured femora as well as the bending stiffness of the contralateral femora was analysed. Therefore, all values are additionally given in percent of the corresponding unfractured femur.

A high resolution micro-computed tomography (µCT) imaging system was used for radiological analysis. After 3D-reconstruction of the callus, the following parameters were determined: tissue volume, bone volume within the overall tissue volume, trabecular thickness, trabecular number and trabecular separation. For comparison of bone mineralisation, the bone mineral density was measured.

For histological analysis, sagittal longitudinal sections were stained according to the trichrome method. The periosteal callus area as well as the bone, cartilage and fibrous tissue area within the periosteal callus area were analysed.

To quantify protein expression, Western blot analyses of BMP-2, RANKL, OPG and VEGF expression were performed.

The blood samples were used to analyse the plasma levels of E2 and T.

The biochemical, radiological, histomorphometric, chemical and Western blot analyses revealed the following results:

Two weeks after surgery, the treatment with AA115 had no influence on the bending stiffness of the fractured femora. However, after four weeks, a significantly higher bending stiffness of the fractured femora could be found in the AA115-treated group when compared to controls.

Neither the periosteal callus area nor the fractions of osseous, cartilaginous and fibrous tissue showed significant differences between the both groups after two weeks. After four weeks, the periosteal callus area of the AA115-treated animals was 61% larger than in vehicle-treated controls. The periosteal callus contained significantly more bone than in vehicle-treated animals, while the cartilage and fibrous tissue areas in the perisoteal callus area did not differ significantly.

Tissue volume and bone volume, measured by µCT, showed no difference between both groups after two weeks. After four weeks, however, the AA115-treated animals tended to have a larger tissue and bone volume than the controls. Neither after two, nor after four weeks, the analyses of trabecular parameters and bone mineral density showed any significant differences.

Treatment with AA115 significantly increased the expression of OPG in callus after two weeks. After four weeks the expression of VEGF was significantly increased in AA115-treated animals.

Treatment with AA115 did not affect plasma levels of E2 and T after two or four weeks. Furthermore, the weight of the seminal vesicles was not affected.

Taken together, this study demonstrates that in a murine fracture model, inhibition of 17β-HSD2 leads to a larger callus with more newly formed bone and thereby increases the mechanical stability of a fractured bone. Selective inhibition of 17β-HSD2 by AA115 did not affect plasma E2 and T concentrations and is therefore unlikely to evoke systemic side-effects.