Response of mammalian eye lenses to space radiation qualities in vitro and in organ culture

Abstract

The eye lens is known to be a radiosensitive mammalian organ, and ionizing radiation is considered to be a widely known risk factor inducing lens opacities. During space missions, astronauts are constantly exposed to galactic cosmic radiation, which contains energetic heavy ions of high linear energy transfer (LET). Due to higher dose and different patterns of cellular energy deposition from the high-LET ions, astronauts have higher risk for developing cataract compared to low-LET radiation exposure on earth. Although the exact mechanism of opacification is not known in detail, it is hypothesized that it initiates from the post-irradiation proliferative activity of genetically damaged lens epithelial cells. As the porcine eye lens resembles the human eye lens in anatomy, size and crystalline content, the DNA damage reaction was investigated in lens organ culture (ex-vivo), in in-vitro cultivated lens epithelial layer and in monolayer culture (porcine lens epithelial cells (pLEC)). Colony forming ability assay demonstrated no significant difference in survival of pLECs with or without a recovery period of 24 h after X-irradiation. Induction of DNA double strand breaks and their repair verified using the molecular marker H2AX was dependent on dose and LET of radiation. In whole lenses, the DSB repair at the central epithelial region seemed to be similar to in-vitro cultivated pLECs whereas more damage persisted at the equatorial region even after a recovery time of 48 h. Investigation of cell cycle progression revealed a dose-dependent G2/M phase arrest in pLECs. Analysis of gene expression by reverse transcriptase quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) demonstrated dose-dependent up-regulation of the CDKN1A gene after both X-rays and carbon-ion exposure, where carbon ions (high-LET) resulted in higher n-fold changes. Osteogenic induction of pLECs with supplementation of inorganic phosphate was verified with Alizarin Red S staining which was visible after 5 days of induction. RT-qPCR analysis showed up-regulation of BMP2, RUNX2 and PAX6 genes whereas down-regulation of COL1A2 gene due to supplementation of osteogenic induction medium. Findings like persistence of DNA-DSB in pLECs and whole lens and cell-cycle disturbances indicate the vulnerability and sensitivity of lens epithelial cells towards ionizing radiation and support the hypothesis of radiation-induced cataract. Misdifferentiation of pLECs to osteogenic type might also be a reason for calcium deposition that leads to lens opacification. Finally, the successful performance of experiments with pLECs and whole lens culture allows porcine lenses to be used as a new cell system for mechanistic and countermeasure studies of lens opacification.

Die Augenlinse ist als strahlungsempfindliches Säugetierorgan bekannt und ionisierende Strahlung gilt als allgemein bekannter Risikofaktor, der eine Linsentrübung verursachen kann. Bei Weltraummissionen sind Astronauten kontinuierlich der galaktischen kosmischen Strahlung ausgesetzt, welche energiereiche schwere Ionen mit hohem linearen Energietransfer (LET) enthält. Aufgrund der höheren Dosis und der unterschiedlichen Muster der Energiedeposition durch die hoch-LET Ionen haben Astronauten ein höheres Risiko, einen Katarakt zu entwickeln, verglichen mit einer Exposition mit Niedrig-LET-Strahlung auf der Erde. Obwohl der genaue Mechanismus der Trübung nicht im Detail bekannt ist, wird angenommen, dass die Trübung durch die Proliferationsaktivität genetisch geschädigter Linsenepithelzellen nach Bestrahlung ausgelöst wird. Da die Schweine-Linse in ihrer Anatomie, Größe und ihrem Kristallingehalt der menschlichen Linse ähnlich ist, wurde die Reaktionen auf DNA-Schäden in der Linsenorgankultur (ex-vivo), in der in-vitro kultivierten Linsenepithelschicht und in Monolayer-Kulturen von Linsenepithelzellen des Schweins (pLEC) untersucht. Der Kolonie-Bildungs-Test (Colony Forming Ability (CFA)-Assay) zeigte, dass es keinen signifikanten Unterschied im Überleben von pLECs nach Röntgenbestrahlung mit 24 h Erholungszeit oder ohne diese gibt. Die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) und deren Reparatur wurde mit dem molekularen Marker H2AX nachgewiesen und war abhängig von der Dosis und dem LET der Strahlung. In ganzen Linsen schien die DSB-Reparatur in der zentralen Epithelregion mit in-vitro kultivierten pLECs ähnlich zu sein, während im äquatorialen Bereich auch nach einer Regenerationszeit von 48 h mehr Schäden persistierten. Die Untersuchung der Zellzyklusprogression zeigte einen dosisabhängigen Stopp der pLECs in der G2/MPhase. Die Analyse der Genexpression durch Reverse Transkriptase quantitative Echtzeit- Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) zeigte eine dosisabhängige Hoch-Regulierung des CDKN1A-Gens nach Röntgen- und Kohlenstoffionen-Exposition, wobei Kohlenstoffionen (hoch-LET) stärkere Hoch-Regulierungen auslösten. Die osteogene Induktion von pLECs durch Supplementierung von anorganischem Phosphat wurde mit Hilfe der Alizarin Red S Färbung verifiziert, die nach fünf Tagen ZUSAMMENFASSUNG - 128 - Induktion sichtbar war. Die RT-qPCR-Analyse ergab eine Hoch-Regulierung der Gene BMP2, RUNX2 und PAX6, während das COL1A2-Gens durch Supplementierung des osteogenen Induktionsmediums eine herunter reguliert wurde. Die Ergebnisse, insbesondere die Persistenz von DNA DSB in pLECs und in der gesamten Linse sowie Störungen im Zellzyklusverlauf, deuten auf die Anfälligkeit und Empfindlichkeit von Linsenepithelzellen gegenüber Exposition mit ionisierender Strahlung hin, welche die Hypothese der strahlungsinduzierten Kataraktbildung unterstützen. Fehldifferenzierung von pLECs zum osteogenen Typ könnte auch ein Grund für Kalziumablagerung sein, die ebenfalls zu einer Linsentrübung führt. Schließlich zeigt die erfolgreiche Durchführung von Experimenten mit pLECs und Ganzlinsenkulturen die Möglichkeit, dass Schweine-Linsen als neues Zellsystem für die mechanistische Untersuchung der Linsentrübung und die Entwicklung von Gegenmaßnahmen verwendet werden können.