Engineering and optimization of Bacillus megaterium for the biosynthesis and biotransformation of terpenoid derived compounds

Abstract

Over the past decades, Bacillus megaterium has been employed for the industrial production of recombinant proteins and active pharmaceutical compounds. However, the limited repertoire of promoter sequences has largely impaired the potential of B. megaterium for the heterologous protein expression and the rational strain design towards a more efficient biosynthesis of these compounds. In the present work, 19 innovative promoter elements of diverse promoter classes were identified based on differential gene expression analyses and characterized via β-galactosidase screening. Their activities ranged from 15% to 145% compared to the reference promoter. Selected promoters were successfully applied to establish the currently most efficient B. megaterium based whole-cell systems for the cholesterol oxidase mediated conversion of pregnenolone to progesterone and the 11β- hydroxysteroid dehydrogenase mediated conversion of cortisol to cortisone. Multigram scaled steroid yields were achieved. Moreover, the novel promoters were used to establish the complex biosynthesis of C30 carotenoids. The involved enzymes in B. megaterium had previously been identified within this work along with the underlying biosynthetic route towards the production of the pharmaceutically relevant C30 carotenoid diaponeurosporene. In summary, the versatile range of applications demonstrated the promising potential of the novel promoters for a future use in diverse biotechnological processes.

Bacillus megaterium wird seit Jahren für die industrielle Produktion von rekombinanten Proteinen und pharmazeutisch aktiven Substanzen eingesetzt. Aufgrund der beschränkten Auswahl an Promotorsequenzen wurde das Potenzial von B. megaterium für die heterologe Proteinexpression und das rationale Stammdesign allerdings weitestgehend vernachlässigt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden 19 innovative Promotoren unterschiedlicher Promotorklassen auf Grundlage von differentiellen Genexpressionsanalysen im B. megaterium Stamm MS941 identifiziert und mittels β- Galaktosidase-Screening charakterisiert. Das Spektrum der Promotoraktivitäten lag im Vergleich zum Referenzpromotor zwischen 15% und 145%. Durch die Anwendung ausgewählter Promotoren konnten die zurzeit effizientesten B. megaterium basierten Ganzzellsysteme für den Cholesteroloxidase vermittelten Umsatz von Pregnenolon zu Progesteron sowie für die 11β- Hydroxysteroid Dehydrogenase katalysierte Produktion von Cortison etabliert werden. Die Steroidausbeuten lagen hierbei im Multigramm Bereich. Des Weiteren konnten die neuen Promotoren erfolgreich für die komplexere Biosynthese von C30-Carotinoiden angewendet werden. Die beteiligten Enzyme wurden zuvor in B. megaterium identifiziert und der Syntheseweg wurde bis zum pharmazeutisch interessanten C30-Carotinoid Diaponeurosporen aufgeklärt. Das breite Anwendungsspektrum der neuen Promotoren zeigt deren enormes Potenzial für eine zukünftige biotechnologische Nutzung.