Calcium-Imaging und funktionelle Charakterisierung von Interdentalzellen in der sich entwickelnden Cochlea der Maus

Abstract

Für eine physiologische Funktion des Innenohrs des Säugetiers sind neben den Sinnes- und Stützzellen auch eine Reihe von azellulären, membranösen Strukturen notwendig. Hierzu gehört auch die Membrana tectoria. Diese wird in der sich entwickelnden Cochlea u. a. von den Interdentalzellen des Limbus spiralis gebildet, welche in der adulten Cochlea auch die Verankerung der ansonsten frei flottierenden Membran bilden.

Für sekretorische Prozesse dienen häufig Calcium-Ionen als second messenger. Hieraus ergab sich die Fragestellung, ob Interdentalzellen altersabhängig spontane Calcium-Signale generieren und ob diese pharmakologisch beeinflusst werden können. Humane in vivo Studien zu den Interdentalzellen sind nicht möglich, daher wurden die Untersuchungen am Mausmodell durchgeführt.

Methodisch kamen das Calcium-Imaging mit dem fluoreszierenden Calcium-Indikator Fluo-8 AM sowie das live cell membrane imaging mit den Membranmarkern FM 4-64 und CellMask Deep Red zum Einsatz. Für diese Experimente und für immunhistochemische Untersuchungen wurden cochleäre Häutchenpräparate (whole-mounts) verwendet; anatomische Studien wurden auch an cochleären Kryoschnitten durchgeführt. Alle mikroskopischen Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning Mikroskop aufgenommen.

Mit Hilfe des live cell membrane imaging konnte die in der Literatur beschriebene, komplexe Anatomie der Interdentalzellen auf dem Limbus spiralis nachvollzogen werden. Die Interdentalzellen waren in säulenartigen Zellreihen angeordnet, welche von aus der Tiefe des Limbus spiralis heraufreichende extrazelluläre Finger („Huschkes Gehörzähne“) unterbrochen wurden. In Richtung des Modiolus nahm diese Ordnung ab. Am postnatalen Tag 4 (P4) zeigten sich kannalikuläre Inhomogenitäten des Zytosols der Interdentalzellen. An P18, also nach dem Hörbeginn der Maus an P12, konnten in vitro erstmalig mobile vesikuläre Strukturen in Interdentalzellen nachgewiesen werden. Immunhistochemisch konnten die ATP-leitenden Proteine Pannexin-1 und Pannexin-2 in Interdentalzellen gezeigt werden.

Den Hauptteil der Arbeit bildete die Messung und Charakterisierung von bis dahin unbekannten Calcium-Signalen in Interdentalzellen in der Phase der cochleären Differenzierung. Interdentalzellen generierten zu allen beobachteten Zeitpunkten (P0, P1, P4, P5 und P18) spontane intrazelluläre Calcium-Transienten. Deren relative Häufigkeit war am Tag 0/1 am geringsten, nahm zum Tag 4/5 auf das 12,5fache zu und sank zu P18 auf das Doppelte des Ausgangswertes ab. Bei allen Altersstufen führte die Stimulation der Interdentalzellen mit den Trinukleotiden ATP und UTP zu Calcium-Transienten unterschiedlicher Amplitude und Form. Vor dem Hörbeginn kam es zu robusten Oszillationen. Am Tag 18, also nach Hörbeginn, kam es zu einer differenziellen Antwort auf ATP-Stimulation. Es wurden entweder oszillierende Calcium-Transienten oder ein initialer Calcium-Peak, welcher von einer Plateauphase gefolgt wurde, beobachtet. Die UTP-Antwort unterschied sich an P18 phänomenologisch nicht von der vor dem Hörbeginn.

Interdentalzellen zeigten im Laufe der cochleären Entwicklung deutliche Veränderungen im Hinblick auf die Häufigkeit, die Amplitude und die kinetischen Eigenschaften spontaner Calcium-Transienten, sowie auf die Antwortmuster bei Stimulation mit ATP und UTP. Ob die spontanen Calcium-Transienten für die Bildung und Aufrechterhaltung der Tektorialmembran nötig sind, können nur weiterführende Untersuchungen klären.

For the physiological function of the mammalian inner ear not only sensory and supporting cells but also a number of acellular, membranous structures are necessary, which includes the tectorial membrane. In the developing cochlea, interdental cells of the spiral limbus secrete material and thereby contribute to formation of the tectorial membrane. Interdental cells also anchor the otherwise free-floating membrane in the mature cochlea.

Calcium ions serve as second messengers in various secretory processes. This led to the question if interdental cells generate age-dependent spontaneous calcium signals and whether these can be pharmacologically modulated. Because these experiments cannot be performed in humans, mice were used as animal model.

Calcium imaging was performed using the fluorescent calcium indicator Fluo-8 AM; for live cell membrane imaging the membrane markers FM 4-64 and CellMask Deep Red were used. For imaging and immunohistochemical experiments cochlear whole-mounts were used; anatomical studies were also performed on cochlear cryosections. Images were acquired with a confocal laser scanning microscope.

Using live cell membrane imaging, the complex anatomy of the interdental cells on top of the spiral limbus was confirmed, which has been described before in histological studies. Interdental cells were arranged in columnar-like rows, which were interrupted by interdigitations of extracellular matrix (\glqq teeth of Huschke\grqq) reaching up from the depth of the limbus spiralis. This orderly arrangement decreased towards the modiolus. On postnatal day 4 (P4), cannalicular-shaped structures within the cytosol of the interdental cells were observed. At P18, after the start of hearing of the mouse at P12, mobile vesicular structures in interdental cells could be detected for the first time in in vitro experiments. Using immunofluorescence, expression of the ATP-conducting proteins pannexin-1 and pannexin-2 was shown in interdental cells.

The main part of this thesis focuses on the measurement and characterization of previously unknown calcium signals in interdental cells during cochlear differentiation. Interdental cells generated spontaneous intracellular calcium transients at all observed ages (P0, P1, P4, P5 and P18). Their relative frequency was lowest on P0/1, increased by a factor of 12.5 on day 4/5 and decreased to twice the initial value on day P18. At all ages, stimulation of interdental cells with the trinucleotides ATP and UTP elicited calcium transients of varying amplitude and shape. Before the onset of hearing, interdental cells responded with robust oscillations. At P18, after the onset of hearing, ATP stimulation caused a differential response with either oscillating calcium transients or an initial calcium peak followed by a plateau phase. The UTP response at P18 was however not different from that before the onset of hearing.

During cochlear development, interdental cells showed significant changes in the frequency, amplitude, and kinetic properties of spontaneous calcium transients, as well as in the response patterns to stimulation with ATP and UTP. Whether the spontaneous calcium transients are necessary for the formation and maintenance of the tectorial membrane needs to be be elucidated in further investigations.