Signalverarbeitung auf der zellulären und molekularen Ebene: Pankreatische β-Zellen und TRPM3-Kanalproteine

Abstract

TRPM3-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle für Na+-und Ca2+-Ionen. Durch die Aktivierung des TRPM3-Kanals durch Pregnenolonsulfat kommt es zu einem verstärkten Ca2+-Einstrom ins Zellinnere. Dadurch werden Stimulus-responsive Transkriptionsfaktoren aktiviert. Bisherige Aktivitätstests von TRPM3 verwendeten die Messung des Ca2+-Einstroms ins Zellinnere. In dieser Arbeit wurde die TRPM3- regulierte Genexpression als Messsystem verwendet. Dabei wurde die Mefenaminsäure als effektivster Inhibitor TRPM3-induzierter Genregulation identifiziert. Desweiteren wurde die Signalkaskade entschlüsselt, die den TRPM3- Kanal mit der Genregulation verknüpft. Dabei sind sowohl extra-als auch intrazelluläre Ca2+-Ionen essentiell zur TRPM3-initiierten Signaltransduktion. Die Proteinkinasen ERK und JNK wurden als Signalüberträger identifiziert. Die Pregnenolonsulfat-Stimulation von TRPM3 aktivierte die Transkriptionsfaktoren Egr- 1, AP-1, ATF2, c-Jun, c-Fos und Elk-1. Die Expression der Proteinphosphatasen MKP-1 und Calcineurin inaktivierte die TRPM3-vermittelte Signaltransduktion. MKP-1 und Calcineurin sind somit Bestandteil eines negativen Rückkopplungsmechanismus. Als zentrale Signalmoleküle von AP-1-aktivierter Genexpression wurden das TRE und das SRE identifiziert. Damit wurde die gesamte Signaltransduktion und Genregulation von TRPM3 aufgeklärt. Weiterhin wurde die Funktion von Elk-1 in pankreatischen β-Zellen untersucht. Bisher war bekannt, dass Elk-1 durch Glukose aktiviert wird. Elk-1 fungiert als ein zentrales Signalmolekül, weil es AP-1 und SRE aktiviert. Um die Funktion von von Elk-1 in vivo zu entschlüsseln wurde ein transgenes Mausmodell generiert, das die dominantnegative Form von Elk-1: REST/Elk-1ΔC in den β-Zellen exprimiert. Die Analyse durch intraperitoneale Glukosetoleranz-Tests stellte heraus, dass die Mäuse hyperglykämische Blutglukosewerte zeigen. Außerdem wurde eine verringerte Größe der Inseln festgestellt, wodurch sich der diabetische Phänotyp erklären lässt.

TRPM3-channels are non-selective cation channels, permeable for Na+-and Ca2+- ions. TRPM3-activation via Pregnenolonesulfate leads to an enhanced Ca2+-influx into the cells which results in activation of stimulus-responsive transcription factors. Previous studies used the measurement of TRPM3-induced Ca2+-influx to analyze TRPM3 activation. In this work, the TRPM3-regulated gene expression is used as a measuring system to analyze TRPM3 activation. Mefenamic acid has been identified to be the most efficient inhibitor in TRPM3-induced gene regulation. In addition, the signaling cascade connecting TRPM3-activation with enhanced gene regulation, has been revealed. In this process, both extra-and intracellular Ca2+-ions are essentiel to induce TRPM3-initiated signaling transduction. The protein kinases ERK and JNK have been identified as signal transducers. Pregnenolonsulfate-stimulation of TRPM3 activates the transcription factors Egr-1, AP-1, Elk-1 and ATF2, c-Jun and c-Fos. Expression of the protein phosphatases MKP-1 and Calcineurin inactivate TRPM3- induced signal transduction. Therefore, MKP-1 and Calcineurin are part of a negative feedback mechanism. As a key target of AP-1-induced gene expression the TRE and SRE have been identified. Hence, the TRPM3-induced signaling pathway and gene regulation has been completely clarified. Furthermore, the function of Elk-1 in pancreatic β-cells has been analyzed. It is known, that Elk-1 is activated via glucose. Elk-1 functions as a component in activating AP-1 and SRE. To analyze the Elk-1-functions in vivo, a transgenic mouse model was generated, that expresses the dominant-negative form of Elk-1; termed REST/Elk-1ΔC; in pancreatic β-cells. Analysis of intraperitoneal glucose tolerance tests revealed that the mice show hyperglycemic blood glucose levels. Further on, a significantly reduced islet size was determined, which explains the diabetic phenotype.