The cystobactamide pathway : enzymological investigation of unusual non-ribosomal peptide biosynthesis mechanisms

Abstract

This thesis focused on the investigation of unusual biosynthetic reactions in the Cystobactamide pathway. Cystobactamides present an unusual hexapeptidic backbone mostly constituted from modified para-amino benzoic building blocks and a unique methoxy-isoasparaginyl moiety. Furthermore, the extensive in trans tailoring makes this pathway particularly interesting from an enzymological point of view. The present work details the in trans biosynthesis of the isopropoxyl decorations carried out on the two last para-amino benzoate units through in vitro reconstitution of these biochemical reactions including the generation of fully functional non-ribosomal peptide synthetase modules in vitro. Furthermore an in-depth biochemical investigation of the unprecedented bifunctional non-ribosomal peptide synthetase domain leading to the isomerization or dehydration of asparagine was performed in parallel with the characterization of the in trans hydroxylation and of the shuttling of this moiety. The self-resistance mechanisms of the producer strain Cystobacter velatus 34 were also investigated in comparison to the self-resistance mechanism for the related antibiotic Albicidin. Finally, attempts at complete in vitro reconstitution of the pathways were performed using the unique heterologous expression platform for non-ribosomal peptide synthetase modules developed during this thesis.

Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Untersuchung ungewöhnlicher biosynthetischer Reaktionen im Cystobactamid-Biosyntheseweg. Cystobactamide haben eine hexapeptidische Grundstruktur, die hauptsächlich aus modifizierten para-Aminobenzoesäure Bausteinen und einer einzigartigen Methoxyisoasparaginyleinheit besteht. Außerdem macht die extensive Verwendung von in trans enzymatischen Modifikationen diesen Biosyntheseweg aus enzymologischer Sichtweise besonders interessant. Die vorliegende Arbeit untersucht durch in vitro Rekonstitution dieser biochemischen Reaktionen, die in trans Biosynthese der Isopropoxyl Dekorationen, die auf den beiden letzten para-Aminobenzoateinheiten entsteht, einschließlich der Erzeugung voll funktionsfähiger nicht ribosomaler Peptidsynthetase-Module in vitro. Außerdem wurde eine umfassende biochemische Analyse der neuen bifunktionellen nicht ribosomalen Peptidsynthetase Domäne durchgeführt, die zur Isomerisierung oder Dehydratisierung von Asparagin führte, parallel zur Charakterisierung der in trans Hydroxylierung und des Transfer dieses Moleküls. Die Eigenresistenzmechanismen des Produzenten Cystobacter velatus 34 wurden im Vergleich zum Selbstresistenzmechanismus des verwandten Antibiotikums Albicidin untersucht. Letztendlich wurden Versuche einer kompletten in vitro Rekonstitution des Biosyntheseweges durchgeführt, mit Hilfe der in dieser Dissertation neuentwickelten heterologen Expressionsplattform für nicht ribosomale Peptidsynthetase-Module.