Strahleninduzierte DNA-Schäden und deren Reparatur in Lymphozyten von Kindern mit malignen Erkrankungen

Abstract

Ziel: Das Ziel dieser Arbeit war es, die Reparatur von strahleninduzierten DNADoppelstrangbrüchen (DSB) bei Kindern mit malignen Erkrankungen zu untersuchen, um mögliche Defizite in der DNA-Reparaturkapazität zu erkennen und nachzuweisen. Hierbei bildete die Untersuchung von DNA-Doppelstrangbrüchen den Schwerpunkt, da diese auf den Organismus ein potentiell hohes Risiko zur Krebsentstehung besitzen. Um die DNAReparaturkapazität von Zellen durch den spezifischen Nachweis nicht reparierter DNADoppelstrangbrüche analysieren zu können, wurde als Nachweismethode die gut etablierte Immunfluoreszenzmikroskopie (IFM) angewendet. Diese Methode ermöglicht die Analyse von DNA-Reparaturfaktoren, die in großer Anzahl in unmittelbarer Umgebung des Bruches rekrutiert werden. Ferner wurden verschiedene Reparaturproteine mittels IFM nachgewiesen und hinsichtlich ihrer Sensitivität untersucht. Material und Methoden: Es wurden Lymphozyten von 45 Kindern mit malignen Erkrankungen im Alter von einem bis 19 Jahren untersucht. Zusätzlich wurden Lymphozyten von 5 gesunden Kontrollkinder als Vergleich hinzugezogen. Die aus den Blutproben der Kinder isolierten Lymphozyten wurden ex-vivo mit 1 oder 2 Gray mit einer einzelnen Fraktion homogen bestrahlt. Im Anschluss an eine immunologische Markierung der Reparaturfaktoren (ATM, 53BP1, γH2AX) wurden 15 Minuten, 8 Stunden und 24 Stunden nach der Bestrahlung die Anzahl vorhandener Foci mittels Immunfluoreszenzmikroskopie quantitativ erfasst. Es wurde die Darstellung durch die Markierung von ATM, 53BP1 und γH2AX miteinander sowie die DSB-Reparaturkinetiken von Kindern mit malignen Erkrankungen mit denen von gesunden Kindern verglichen. Ergebnisse: Es zeigten sich Hinweise auf Defizite in der DNA-Reparaturkinetik von erkrankten Kindern gegenüber gesunden Kontrollkindern. Insbesondere in der Einzelbetrachtung der untersuchten Proben fielen deutliche Unterschiede auf. Die drei betrachteten Reparaturproteine zeigten einen ähnlichen zeitlichen Verlauf der DNAReparatur. Es konnten geringe Unterschiede in der Anzahl der Foci bei ATM und 53BP1 gegenüber der γH2AX Antikörperfärbung gezeigt werden. Schlussfolgerung: Die in dieser Arbeit untersuchten Kinder mit malignen Erkrankungen zeigten zum Teil Einschränkungen in der DSB-Reparaturkapazität die im oberen Toleranzbereich lagen. Es liegt die Vermutung nahe, dass Kinder mit malignen Erkrankungen Einschränkungen in der Reparatur von DSB aufweisen können. Dabei scheint die Aufbewahrung der Zellen durch Kryokonservierung möglicherweise einen selektiven Einfluss auf die isolierten Lymphozyten auszuüben. Die markierten Reparaturproteine stellten im Vergleich miteinander den Verlauf der DNA-Reparaturkinetik zuverlässig dar.

DNA-Damage repair in lymphocytes of children treated for pediatric malignancies Purpose: The origin of pediatric malignancies in healthy children remains largely unclear. The purpose of the current doctoral study is the investigation of the DNA repair capacity in children diagnosed with cancer, and the identification of potential deficiencies in the repair of DNA. The study focused on DNA double strand-breaks (DSBs) due to their potential high risk of carcinogenesis. To analyse the DNA repair capacity of DSBs the research used the immunofluorescence analysis to quantify DNA damage response proteins by light microscopy (foci). This allows to analyze the kinetic of DNA damage response proteins that are located nearby the DSB. Material and Methods: Kinetics of DSB repair in lymphocytes of 45 children with histologically confirmed tumors or leukemias was compared to that of 5 healthy children. In order to generate DSBs in the DNA, isolated lymphocytes were irradiated with single doses of 1 or 2 Gray. The repair proteins Ataxia teleangiectasia mutated (ATM), p53-binding protein 1 (53BP1) and γH2AX were visualized as foci. This was followed by counting the foci by means after 15 minutes, 8 hours and 24 hours. After that the study compared the mean of foci of the children with pediatric malignancies with the healthy children and we compared the repair kinetics of the three different colorings of antibodies. Results: The test results showed slighty differences in mean DSB repair capacity between children with pediatric malignancies and healthy control-children. Three different colorings of antibodies broadly reflected the same temporal course of DNA repair kinetics; however, slight differences could be noticed in the absolute rate of double strand breaks in ATM and 53 BP1 towards the γH2AX coloring of antibodies. Conclusion: Some of the children affected by malignant diseases who were subject of this study still showed impaired DSB repair kinetics within the upper tolerance levels. This leads to the conclusion that children with pediatric malignancies can show signs of impaired kinetics of DSB repair. Here, the keeping of cells using cryopreservation appears to have a potential selective influence on the isolated lymphocytes. The comparison of the marked repair proteins illustrates the DNA repair kinetics with sufficient reliability.