Effekt der Überexpression des chondrogenen Transkriptionsfaktors SOX9 durch rekombinante adenoassoziierte virale (rAAV) Vektoren in Kombination mit Trägermaterialien auf die frühe Knorpelreparatur im translationalen Großtiermodell

Abstract

Die Regenerationsfähigkeit des hyalinen Gelenkknorpels ist begrenzt. Die Suche nach innovativen Methoden zur Knorpelheilung ist Gegenstand intensiver Forschung. Gentherapie und Gewebszüchtung (Tissue Engineering) sind vielversprechende Ansätze. Die vorliegende Arbeit untersucht, ob die frühe Reparatur fokaler vollschichtiger Knorpeldefekte im Großtiermodell in vivo durch in situ Applikation von Biomaterialien und eines replikationsdefekten, rekombinanten adeno-assoziierten viralen Genvektors (rAAV), der eine cDNS des humanen Transkriptionsfaktors SOX9 trägt, verbessert wird. Folgende Hypothesen wurden speziell überprüft: (1) Alleinige Überexpression von SOX9 beladenen rAAV-Vektoren verbessert die Knorpelreparatur im Vergleich zur Kontrollgruppe mit lacZ-beladenen rAAV-Vektoren. (2) Überexpression von rAAV-SOX9 in autologem Knochenmarkaspirat verbessert die Knorpelreparatur im Vergleich mit der rAAV-lacZ-Kontrollgruppe. (3) Überexpression von rAAV-SOX9 in Kombination mit einem soliden Biomaterial verbessert die Knorpelreparatur im Vergleich mit der rAAV-lacZ-Kontrollgruppe. (4) Überexpression von rAAV-SOX9 in Kombination mit einem thermosensitiven Hydrogel verbessert die Knorpelreparatur im Vergleich mit der rAAV-lacZ-Kontrollgruppe. (5) Überexpression von rAAV-SOX9 in Kombination mit einem thermosensitiven Hydrogel ist allen anderen hier untersuchten Ansätzen hinsichtlich der Verbesserung der Knorpelreparatur überlegen. Für die Studie wurden zwölf adulte weibliche Göttinger Minipigs ausgewählt und vollschichtige chondrale Defekte in der Trochlea femoris mit entweder rAAV-SOX9, rAAV-SOX9 in Knochenmarkaspirat, einem PCL-Trägermaterial und rAAV-SOX9 in Knochenmarkaspirat, rAAV-SOX9 im thermosensitiven PF127-Hydrogel oder als Negativkontrolle rAAV-lacZ behandelt. Vier Wochen postoperativ erfolgte die Entnahme der Kniegelenke und die Analyse der Defektreparatur makroskopisch, histologisch, immunhistochemisch und in der Mikrofokuscomputertomographie (μ- CT). Die Daten zeigen, dass (1) die alleinige Überexpression von rAAV-SOX9 die Knorpelreparatur im Vergleich mit der rAAV-lacZ-Kontrollgruppe signifikant verbessert. Sie zeigen weiterhin, dass (2) Überexpression von rAAV-SOX9 in autologem Knochenmarkaspirat die Knorpelreparatur im Vergleich mit der rAAVlacZ- Kontrollgruppe verbessert. Die Hypothese, dass (3) eine Überexpression von rAAV-SOX9 in Kombination mit einem soliden Biomaterial die Knorpelreparatur im Vergleich mit der rAAV-lacZ-Kontrollgruppe verbessert, wurde widerlegt. Schließlich demonstrieren die Daten, dass (4) die Überexpression von rAAV-SOX9 in Kombination mit einem thermosensitiven Hydrogel den singulären Parameter „Defektarchitektur“ im Vergleich zur rAAV-lacZ-Kontrollgruppe verbessert. Zuletzt wurde die Hypothese (5) verworfen, dass Überexpression von rAAV-SOX9 in Kombination mit einem thermosensitiven Hydrogel allen anderen untersuchten Ansätzen hinsichtlich der Verbesserung der Knorpelreparatur überlegen ist. Somit zeigen die Daten zusammenfassend, dass die rAAV-vermittelte Überexpression von SOX9 im Tiermodell zu einer verbesserten osteochondralen Reparatur führt. Die Daten demonstrieren weiterhin, dass die Defektreparatur durch Zusatz von Knochenmarkaspirat sowie durch Kombination von Prinzipien der Gentherapie (rAAV-SOX9) mit Tissue Engineering (PF127/PCL) zusätzlich verbessert werden kann.

Overexpression of the chondrogenic transcription factor SOX9 via recombinant adeno associated viral (rAAV) vectors in combination with biomaterials and its effect on early cartilage repair in a large animal model The ability of hyaline articular cartilage to regenerate is limited. The quest for innovative methods to treat focal cartilage defects is the subject of intensive research. Gene therapy and tissue engineering are promising approaches in this regard. The present thesis investigates whether the early repair of focal, full-thickness articular cartilage defects in a large animal model in vivo is improved by in situ application of biomaterials and a replication-defective, recombinant adeno associated viral (rAAV) gene vector carrying a cDNA of the human transcription factor SOX9. The following hypotheses were examined: (1) Sole overexpression of rAAV-SOX9 improves cartilage repair as compared to the control group (lacZ-rAAV vectors). (2) Overexpression of rAAV-SOX9 in autologous bone marrow aspirate improves the cartilage repair in comparison with the rAAV-lacZ control group. (3) Overexpression of rAAV-SOX9 in combination with a solid biomaterial improves cartilage repair compared with the rAAV-lacZ control group. (4) Overexpression of rAAV-SOX9 in combination with a thermosensitive hydrogel improves cartilage repair in comparison with the rAAV-lacZ control group. (5) Overexpression of rAAV-SOX9 combined with a thermosensitive hydrogel is superior to any other investigated approaches. Twelve adult female Minipigs received focal full-thickness chondral defects in the trochlea groove and were treated with either rAAV-SOX9, rAAV-SOX9 in bone marrow aspirate, rAAV-SOX9 in a poly-ε-caprolacton(PCL) scaffold and rAAV-SOX9 in the thermosensitive PF127 hydrogel, or similarly with rAAV-lacZ as a negative control. Four weeks postoperatively, osteochondral repair was analyzed macroscopically, histologically, immunohistochemically and using microfocus computer tomography (μ-CT). The data show that (1) sole overexpression of rAAV-SOX9 simultaneously improves cartilage repair in comparison with the rAAV-lacZ control group. They further reveal that (2) overexpression of rAAV-SOX9 in autologous bone marrow aspirate improves chondral repair by comparison with the rAAV-lacZ control group. The hypothesis that (3) overexpression of rAAV-SOX9 combined with a solid scaffold leads to better cartilage repair than the lacZ control group was rejected. After all the data show that (4) the overexpression of rAAV-SOX9 in combination with a thermosensitive hydrogel optimizes the singular parameter "defect architecture" compared to the rAAV-lacZ control group. Finally, the hypothesis was rejected that (5) overexpression of rAAVSOX9 in combination with a thermosensitive hydrogel is superior to all other approaches studied regarding articular cartilage repair. In conclusion the data show that rAAV-mediated overexpression of SOX9 in a translational large animal model improves osteochondral repair. The data also demonstrate that defect repair can be further improved by the addition of bone marrow aspirate and by combining gene therapy (rAAV-SOX9) with tissue engineering principles (PF127/scaffold).