Die Anti-apoptotische Wirkung von Granulozyten-Kolonie stimulierendem Faktor (G-CSF) nach inkompletter traumatischer Nervenschädigung des N. ischiadicus der Ratte

Abstract

Der Granulozyten-Kolonie stimulierende Faktor (G-CSF) hat, wie in vorausgehenden Studien gezeigt, anti-apoptotische, antiinflammatorische, neuroprotektive und neuroregenerative Eigenschaften. In der vorliegenden Studie wurde analysiert, inwiefern sich die Gabe von G-CSF auf die Regenerationsfähigkeit des Nervus ischiadicus der Ratte nach inkompletter Schädigung auswirkt. Ein besonderes Augenmerk lag auf der möglichen anti-apoptotischen Wirkung von G-CSF auf den Erhalt der dem N. ischiadicus zugehörigen α-Motoneuronen. Nach mikrochirurgischer Präparation des rechten N. ischiadicus von erwachsenen, männlichen Spraque-Dawley-Ratten wurde eine Läsion mit einem Wasserstrahldissektor in einer Stärke von 80 bar gesetzt. Insgesamt wurden 48 Tiere in zwei verschiedenen Gruppen untersucht. Eine Gruppe erhielt intravenös G-CSF. Die andere, als Kontrollgruppe fungierende Gruppe, erhielt 5%ige Glukoselösung (G5%). Jede dieser zwei Gruppen wurde in vier Untergruppen mit jeweils sechs Tieren eingeteilt. Der Beobachtungszeitraum der Tiere umfasste bis zu 14 Tage. G-CSF respektive G5% wurden je nach Untergruppe direkt postoperativ oder am ersten, zweiten oder dritten postoperativen Tag appliziert. An diesen Tagen erfolgte auch die Evaluation des neurologischen Defizits mittels Lauftests und der Ableitung der motorischen Nervenleitgeschwindigkeit (mNLG). Nach Abschluss der klinischen Untersuchung und Tötung der Tiere erfolgte die histologische Aufarbeitung der Rückenmarkssegmente L4 bis L6. Zum Nachweis möglicher anti-apoptotischer Aktivität wurde die Expression der Cholin-Acetyl-Transferase (ChAT), des Granulozyten-Kolonie stimulierenden Faktor Rezeptors (G-CSFR), und von Bcl-2, einem anti-apoptotischen Protein, sowie von Bax, einem pro-apoptotischen Protein, mittels immunhistochemischer Färbung untersucht. Verglichen mit der Kontrollgruppe ergab sich in Bezug auf die Lauftests und Ableitung der motorischen Nervenleitgeschwindigkeit für die Behandlung mit G-CSF ein positiver Trend, jedoch keine Signifikanz hinsichtlich einer überlegenen funktionellen Regeneration innerhalb der ersten 14 Tage. Immunhistochemisch zeigte sich, dass es nach gesetzter Nervenläsion auf der rechten Seite bei der Kontrollgruppe histologisch zu einer signifikant reduzierten Anzahl an α-Motoneuronen des Rückenmarkes verglichen mit der unbehandelten linken Seite kam. Bei der Gruppe mit G-CSF Behandlung gab es hingegen keinen Unterschied zwischen der Anzahl der α-Motoneurone auf beiden Seiten. Auch die Antikörperfärbung gegen G-CSFR verhielt sich dementsprechend: Während bei der Kontrollgruppe auf der rechten Seite des Rückenmarks eine signifikant geringere Anzahl an α-Motoneuronen mit G-CSF-Rezeptor-Expression als auf der nicht geschädigten Seite vorlag, war bei den Tieren mit G-CSF Gabe die Anzahl der α- Motoneurone mit G-CSF-Rezeptor-Expression auf beiden Seiten gleich. Der Nachweis des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 zeigte, dass bei der Kontrollgruppe im Vergleich zur ungeschädigten linken Seite auf der rechten Seite des Rückenmarks die Bcl-2-positiven Zellen reduziert vorlagen. Demgegenüber war bei der G-CSF Gruppe die Anzahl der Bcl-2-positiven Zellen auf beiden Seiten gleich. Passend dazu verhielt sich die Antikörperfärbung gegen das pro-apoptotische Protein Bax. Hier waren bei der Kontrollgruppe die positiv gefärbten Zellen auf der geschädigten rechten Seite des Rückenmarks häufiger zu sehen als auf der intakten linken Seite. In der Gruppe mit G-CSF-Behandlung zeigte sich dagegen, dass auf beiden Seiten des Rückenmarkes die Bcl-2-positiven Zellen in gleicher Anzahl vorlagen. Zudem konnte mittels Fluoreszenz-Doppelfärbungen gezeigt werden, dass in α- Motoneuronen, die durch den spezifischen Marker ChAT identifiziert wurden, gleichzeitig auch G-CSFR, Bcl-2 und Bax nachweisbar waren. Somit konnte für die durchgeführten Analysen verifiziert werden, dass in den verschiedenen Antikörperfärbungen jeweils spezifisch α-Motoneurone gefärbt und ausgewertet wurden. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Gabe von G-CSF eine protektive Wirkung hinsichtlich der durch eine traumatische Läsion induzierten Apoptose von α- Motoneuronen zu haben scheint. Dies könnte sich trotz fehlender Signifikanz in den ersten 14 Tagen positiv auf die Langzeitregeneration des geschädigten Nervs hinsichtlich der Funktion auswirken.

Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) has been shown to have antiapoptotic, antiinflammatoric, neuroprotective and neuroregenerative properties. The present study investigated the potential regenerative effect of G-CSF after incomplete traumatic sciatic nerve lesion in a rat model and its possible influence on the α-motor neurons in the spinal cord. After performing a microsurgical preparation of rats’ right sciatic nerves, a lesion was created using a water-jet dissector with a pressure of 80 bar. In total, 48 animals were assigned to two groups. Animals of one group underwent treatment with intravenous G-CSF. The other group serving as control group was treated with glucose 5%-solution. Every group was divided into four subgroups of six animals. G-CSF or glucose 5%-solution, respectively, was applied directly postoperative and, depending on the subgroup, at day one, three and five after surgery. Neurological deficits were evaluated by using walking tests and electrophysiological examinations. At the end of the observation period the animals were sacrificed for histological evaluation of the lumbar spinal cord’s segments L4 to L6. Immunohistochemical staining for detection of choline-acetyltransferase (ChAT), granulocyte-colony stimulating factor-receptor (G-CSFR), as well as Bcl-2, an antiapoptotic protein, and Bax, a pro-apoptotic protein was performed. The walking tests and motoric nerve impulse tests showed a positive trend towards a faster improvement in rats that have been treated with G-CSF compared to the control group. Nevertheless, statistic evaluation failed to show significance. ChAT staining revealed a significantly reduced number of α-motoneurons on the injured right side of the spinal cord compared with the contralateral left side. In animals that received G-CSF, no differences between the numbers of α-motoneurons on both sides were detected. Antibody staining against G-CSFR obtained the same result. In the control group, the numbers of α-motoneurons and positivity for G-CSFR were significantly lower on the lesioned side of the spinal cord whereas the numbers of α-motorneurons with positivity for G-CSFR was not decreased significantly compared to the contralateral side in animals of the G-CSF-group. Additionally, the number of Bcl-2-positive cells and signs of anti-apoptosis were reduced on the damaged side compared with the contralateral side. In animals that received G-CSF, the number of Bcl-2-positive cells were equal on both sides. Accordingly, the antibody staining against the pro-apoptotic protein Bax displayed more positive stained cells on the damaged side than on the intact side of the spinal cord in the control group. In the G-CSF-group, no differences in the number of Bax-positive cells between the two sides were detected. Fluorescent double staining of α-motoneurons revealed a positive simultaneous expression of G-CSF-R, Bcl-2 and Bax. Thus, the application of G-CSF after peripheral nerve trauma revealed strong antiapoptotic effects on spinal cords α-motoneurons of the sciatic nerves’ section. Although no functional benefit could be shown in the first two weeks, there might be long-term beneficial effects regarding peripheral nerve regeneration after a traumatic lesion.