Strahleninduzierte DNA-Schäden im Kontext des Chromatins : Elektronenmikroskopische Analysen humaner Zellen nach Exposition mit unterschiedlichen Strahlenqualitäten

Abstract

Die Reparatur von strahleninduzierten Desoxyribonukleinsäure (DNA)- Doppelstrangbrüchen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität. Inwieweit die Dichte und Komplexität von strahleninduztierten DNA-Schäden (DNA-Schadensmuster) einen Einfluss auf die Chromatinstruktur nehmen und die Reparatur beeinflussen, stellen wichtige und zu klärende Fragen dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden humane, dermale Fibroblasten mit verschiedenen Strahlenqualitäten bestrahlt, um das DNA-Schadensmuster sowie Veränderungen in der Chromatinstruktur während der DNA-Schadenantwort und im zeitlichen Verlauf des Reparaturprozesses zu charakterisieren. Dabei konnten nach der Bestrahlung verschiedene Reparaturfaktoren über immunologische Markierungen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie oder Transmissionselektronenmikroskopie genauer untersucht werden. Mit der hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopie wurden die zentralen Reparaturproteine der Nicht-homologen End-zu-End Verknüpfung auf Einzelmolekülebene im Chromatinkontext (Euchromatin, Heterochromatin) dargestellt. Im Verlauf der DNA-Schadensantwort konnten sowohl nach Photonenbestrahlung, als auch nach Teilchenbestrahlung Chromatinumstrukturierungen festgestellt werden. Insbesondere nach der Teilchenbestrahlung traten massive, dekondensierte Chromatin-Regionen auf. Im weiteren Verlauf der Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Chromatinveränderungen mit der Akkumulation der verschiedenen Reparaturfaktoren assoziiert waren und in Verbindung mit der Reparatur standen. Dabei traten nach Photonenbestrahlung isolierte DNA-Schäden im gesamten Zellkern auf, die effizienter als nach Teilchenbestrahlung repariert werden konnten. Nach Teilchenbestrahlung zeigten sich hingegen zahlreiche Doppelstrangbrüche in räumlicher Nähe zueinander, die überwiegend in der heterochromatischen Peripherie der dekondensierten Chromatin-Regionen lokalisiert waren. Diese komplexen Schäden, die vermutlich in Verbindung mit den massiven Chromatinveränderungen standen, wurden zeitlich verzögert und ineffizient repariert. Dabei besteht die Annahme, dass sie die Wiederherstellung der ursprünglichen Chromatinkostitution verhinderten und somit die funktionelle Organisation der Zelle beeinflussten. Diese Erkenntnisse machen deutlich, dass die Reparatur maßgeblich durch das DNA-Schadensmuster beeinflusst wird. Die Umstrukturierung des Chromatins ist dabei ein essentieller Prozess und nimmt somit eine wichtigere Rolle ein, als bisher angenommen wurde.

The repair of radiation-induced DNA (deoxyribonucleic acid) double-strand breaks is crucial for maintaining genomic integrity. The effect that the density and complexity of these radiation-induced damages has on chromatin structure and repair efficiency poses a considerable question. In this study, human dermal fibroblasts were irradiated with various radiation qualities to characterize DNA damage patterns, as well as, changes in chromatin structure during the DNA damage response within the time course of the repair process. Following irradiation, several repair factors were investigated by immunofluorescence microscopy or transmission electron microscopy. Using high-resolution transmission electron microscopy, the central repair proteins of the non-homologous end-joining repair pathway could be visualized in the context of the chromatin ultrastructure (euchromatin, heterochromatin) at a single-molecule level. In the course of the DNA damage response, chromatin reorganization was detected after both photon irradiation and charged particle irradiation. In particular, massive decondensed chromatin regions appeared after particle irradiation. Further investigations showed that these chromatin alterations were associated with the accumulation of various repair factors and the repair process. Photon irradiation resulted in isolated DNA damage throughout the entire nucleus which subsequently was efficiently repaired. After particle irradiation, however, numerous double-strand breaks were found in close proximity and located predominantly in the heterochromatic periphery of the decondensed chromatin regions. These complex damages are believed to be related to the massive chromatin changes and their repair was delayed and inefficient. It is assumed that this prevented the restoration of the original chromatin constitution and thus influenced the functional organization of the cell. These findings clarify that repair efficiency is significantly influenced by the DNA damage pattern. Chromatin restructuring is therefore an essential process and plays a more decisive role than previously thought.