Die Bedeutung exosomaler RNAs für das muskelinvasive Harnblasenkarzinom

Abstract

Die Tumorentstehung und -progression wird maßgeblich durch die Interaktion von Tumorzellen und ihrer Tumormikroumgebung beeinflusst. Exosomen und die darin verpackten miRNAs spielen eine essentielle Rolle sowohl in der lokalen Interaktion zwischen Tumor und seiner Tumormikroumgebung als auch in der systemischen Interaktion der Tumorzellen mit späteren Metastasierungsorten. Durch die systemische Sezernierung können Exosomen als potenzielle diagnostische und prognostische Biomarker in Körperflüssigkeiten verwendet werden. Muskelinvasive Harnblasentumore sind durch invasions-assoziierte miRNA-Signaturen gekennzeichnet, die potenziell als Biomarker in Primärtumorgewebe, aber auch als nicht invasive Biomarker durch die Analyse von Exosomen aus Körperflüssigkeiten eine Anwendung finden können. Inwieweit sich invasionsabhängige miRNA-Signaturen in tumorassoziierten Exosomen des Harnblasenkarzinoms wiederfinden lassen, ist unklar. Daher war das erste Ziel dieser Arbeit die Identifizierung von invasions-assoziierten miRNA-Mustern in Harnblasenkarzinomzelllinien und ihren sezernierten Exosomen. Darüber hinaus sollte die funktionelle Bedeutung tumor-assoziierter Exosomen in der Interaktion zwischen Harnblasenkarzinomen und ihrer Tumormikroumgebung analysiert werden. Dafür wurden zunächst 5 Harnblasenkarzinomzelllinien basierend auf publizierten Daten sowie Ergebnissen eines Invasionsassays in die Gruppen invasive (T24; J82; 253J-BV) und nicht invasive (RT112; 5637) Harnblasenkarzinomzellen eingeteilt. Die Optimierung der Exosomen-Isolation erfolgte für die Standardmethode Ultrazentrifugation sowie die Kitbasierte Präzipitation. Mit Hilfe beider Isolationsvarianten konnten 30-150 nm große exosomale Vesikel isoliert werden, die die typische vesikuläre Struktur und hohe Mengen der exosomalen Marker CD81 und Syntenin aufwiesen. Dabei konnten keine zellulären Kontaminationen detektiert werden. Die miRNA-Expressionsanalyse von Harnblasenkarzinomzelllinien und ihren Exosomen wurde in Abhängigkeit von der Invasivität der parentalen Zellen mit Hilfe der Microarray Technologie durchgeführt. Invasive Harnblasenkarzinomzellen sind durch 37 signifikant differentiell exprimierte miRNAs charakterisiert, wovon fünf (miR-137-3p; -141-3p; -200a- 3p; -205-5p; -99a-5p) mittels qPCR verifiziert werden konnten. Ihre sezernierten Exosomen weisen verglichen zu Exosomen sezernierten von nicht invasiven Harnblasenkarzinomzellen 15 signifikant deregulierte miRNAs auf. Davon konnten ebenfalls fünf miRNAs (miR-30a- 3p; -137-3p; -141-3p; -205-5p; -99a-5p) mit Hilfe der qPCR bestätigt werden. Neun miRNAs (miR-137-3p; -141-3p; -200a-3p; -200b-3p; -200c-3p; -205-5p; -224-5p; -429-3p; -99a-5p) sind in Abhängigkeit von der Invasivität signifikant zwischen den Ausgangszellen, aber auch in ihren sezernierten Exosomen dereguliert. Weiterhin konnte eine exosomenspezifische miRNA-Signatur von sechs miRNAs sowie eine zellspezifische Signatur von 28 miRNAs detektiert werden. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass invasive Harnblasentumore sowohl intrazellulär als auch exosomal durch spezifische miRNA-Signaturen gekennzeichnet sind. Um die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf Patienten-abgeleitete Proben (Primärtumore; Urinexosomen) zu prüfen, wurde ein weiteres globales Screening der miRNA-Expression an Gewebeproben von Patienten mit nicht muskelinvasiven und muskelinvasiven Harnblasenkarzinomen durchgeführt. Dabei konnten 63 miRNAs identifiziert werden, die signifikant in muskelinvasiven Harnblasentumoren im Vergleich zu nicht muskelinvasiven Harnblasentumoren dereguliert sind. Sechs von 63 miRNAs (miR-141-3p; -200a-3p; -200a- 5p; -200b-3p; -205-5p; -429-3p) waren ebenfalls signifikant differentiell exprimiert in invasiven Harnblasenkarzinomzelllinien. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass sich das hier angewendete in vitro Modell für die Untersuchung invasions-assoziierter miRNA-Muster und die dadurch ausgelösten Prozesse eignet. Anschließend wurde die Eignung der exosomalen invasions-assoziierten miRNA-Signaturen als mögliche diagnostische Biomarker in „liquid biopsies“ unter Verwendung von Urinexosomen aus Patienten mit einem nicht muskelinvasiven und muskelinvasiven Harnblasentumor getestet. Die miRNA miR-200a-3p konnte als einzige mit einer tendenziellen Herunterregulation in Urinexosomen von Patienten mit einem muskelinvasiven Tumor verglichen zu Patienten mit einem nicht muskelinvasiven Tumor bestätigt werden. Alle anderen sieben miRNAs (miR-27b-3p; -30a-3p; -137-3p; -141-3p; -145-5p; -200a-3p; - 205-5p; -99a-5p) zeigten keine differentielle Expression. In Zukunft sollte die Identifizierung spezifischer exosomaler miRNAs direkt an Urinproben erfolgen, da in Körperflüssigkeiten neben tumor-assoziierten auch Exosomen aus anderen Zellen existieren und somit eine direkte Übertragung des in vitro Modells auf Patienten-abgeleitete Proben nicht möglich ist. Im weiteren wurde der funktionelle Einfluss tumor-assoziierter Exosomen auf normale Harnblasenfibroblasten als Bestandteil der Tumormikroumgebung untersucht. Zunächst wurde mittels Fluoreszenzmarkierung die zeitabhängige Aufnahme von durch eine invasive (T24) sowie eine nicht invasive (RT112) Harnblasenkarzinomzelllinie sezernierten Exosomen in normale hTERT-immortalisierte Vorhautfibroblasten demonstriert. Exosomen wurden unabhängig von der Invasivität der Ausgangszellen schnell und effektiv innerhalb von 6 h internalisiert und waren nach 48 h verarbeitet. Weiterhin konnte erstmalig für das Harnblasenkarzinom gezeigt werden, dass Harnblasenkarzinomzellen eine nicht humane miRNA (cel-miR-39-3p) über Exosomen auf andere Zellen (normale hTERT-immortalisierte Vorhautfibroblasten; tumor-assoziierte Fibroblasten) übertragen können. Dabei konnte unabhängig von der Invasivität der parentalen Harnblasenkarzinomzellen eine Korrelation zwischen miRNA-Expression und der eingesetzten Exosomen-Menge belegt werden. Das letzte Ziel dieser Arbeit lag in der Analyse des funktionellen Einflusses tumorassoziierter Exosomen auf tumorfördernde Prozesse (Proliferation; Migration) in normalen Harnblasenfibroblasten. Nach erfolgreicher Etablierung der Proliferationsmessung unter Verwendung von hTERT-immortalisierten Vorhautfibroblasten wurde das Proliferations- und Migrationsverhalten nach Stimulation mit tumor-assoziierten Exosomen untersucht. Von normalen Harnblasenzellen sezernierte Exosomen induzierten eine signifikante Erhöhung der Proliferation von Harnblasenfibroblasten verglichen zu unbehandelten Zellen, zeigten jedoch keinen Einfluss auf das Migrationsverhalten der Zielzellen. Die Proliferation und Migration von Harnblasenfibroblasten wurde unabhängig von der Invasivität der parentalen Zellen, aber zellspezifisch verglichen zu normalen Exosomen beeinflusst. In der Regel kam es zur Verstärkung beider Prozesse, wobei vor allem Exosomen der Zelllinie RT112 zu diesen Effekten führten. Der zellspezifische Einfluss war dabei unabhängig von der Stimulationszeit und für die Proliferation auch unabhängig von der eingesetzten Exosomen-Konzentration. Von Harnblasenkarzinomzellen sezernierte Exosomen beeinflussen tumorfördernde Prozesse in Zellen ihrer Tumormikroumgebung, wodurch die Tumorprogression und Metastasierung begünstigt werden kann. Welche Mechanismen und Moleküle dafür verantwortlich sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit müssen weiterführende Analysen die Rolle der exosomalen Bestandteile in der Interaktion zwischen dem Harnblasenkarzinom und Fibroblasten analysieren. Das dadurch gewonnene Wissen über die intrazellulären und extrazellulären Signalwege des Harnblasenkarzinoms kann zu einem besseren Verständnis der Entwicklung, Progression und Metastasierung des Harnblasenkarzinoms beitragen, welches zu einer individuellen Prognosebewertung und Therapiewahl sowie zur Entwicklung von zielgerichteten Medikamenten führen kann.

Tumor development and progression is influenced by the interaction of tumor cells and their tumor microenvironment. Exosomes and miRNAs packaged in exosomes play an important role in both, the local interaction of the tumor cells and the tumor microenvironment and the systemic interaction at the site of metastasis. Due to the systemic secretion exosomes, they can also be used as potential diagnostic and prognostic biomarkers in body fluids. Muscle-invasive bladder cancer is characterized by invasion-associated miRNA signatures, which can be potentially used as biomarkers in primary tumors, but also as non-invasive biomarkers by analyzing exosomes from body fluids. However, it is not clear, to what extent the invasion-dependent miRNA signature is present in secreted exosomes. Therefore, the first aim of this study was the identification of invasion-associated miRNA signatures in urinary bladder cancer cell lines and their secreted exosomes. In addition to this, the functional relevance of tumor-associated exosomes for the interaction of urinary bladder cancer cells with fibroblasts as a part of tumor microenvironment should be analyzed. Based on publications as well as invasion assays 5 urinary bladder cancer cell lines were initially classified into invasive (T24; J82; 253J-BV) and non-invasive (RT112; 5637) urinary bladder cancer cells. Afterwards, the exosome isolation was optimized for the standard method ultracentrifugation and for a kit-based precipitation. Using the two methods it was possible to isolate exosomal vesicles with a size distribution of 30-150 nm, typical vesicular morphology and high amounts of exosomal markers CD81 and syntenin. No cellular contamination was detected. The analysis of miRNA expression was performed on urinary bladder cancer cells and their exosomes depending on the invasiveness of parental cells by using the microarray technology. Invasive urinary bladder cancer cells are characterized by 37 significantly differentially expressed miRNAs. Five miRNAs (miR-137-3p; -141-3p; -200a-3p; -205-5p; -99a-5p) could be verified by qPCR. Their secreted exosomes exhibit 15 significantly deregulated miRNAs compared to exosomes secreted by non-invasive urinary bladder cancer cells. Five miRNAs (miR-30a-3p; -137-3p; -141-3p; -205-5p; -99a-5p) were confirmed by qPCR. Nine miRNAs (miR-137-3p; -141-3p; -200a-3p; -200b-3p; -200c-3p; -205-5p; -224-5p; -429-3p; -99a-5p) are significantly deregulated both in urinary bladder cancer cells and their secreted exosomes depending on the invasiveness. Furthermore, an exosome-specific miRNA signature of 6 miRNAs and a cell-specific signature of 28 miRNAs were detected. For the first time, we could demonstrate that invasive urinary bladder cancer cells are characterized by specific intracellular and exosomal miRNA signatures. In order to prove the transferability of these results to patient-derived samples a global screening of miRNA expression was performed on tissue samples obtained from patients with non muscle-invasive and muscle-invasive bladder cancer. Thereby, 63 miRNAs were identified, which are significantly deregulated in muscle-invasive bladder cancer. Six out of these 63 miRNAs (miR-141-3p; -200a-3p; -200a-5p; -200b-3p; -205-5p; -429-3p) were also significantly differentially expressed in the invasive urinary bladder cancer cell lines. So it can be concluded that the used in vitro model is suitable for the analysis of invasion-associated miRNA patterns and the processes triggered by them. Subsequently, the suitability of the exosomal invasion-associated miRNA signature as possible diagnostic biomarker in liquid biopsies was examined by using urine exosomes from patients with non muscle-invasive and muscle-invasive bladder cancer. Only miRNA miR- 200b-3p could be confirmed with a tendency of down-regulation in urine exosomes of muscle-invasive bladder cancer patients compared to non muscle-invasive bladder cancer patients. The other 7 miRNAs did not show any differential expression. In the future, the identification of specific exosomal miRNAs should be carried out directly by using urine samples, because body fluids also contain - additionally to tumor-associated exosomes - exosomes secreted by other cell types and therefore, the direct transferability of in vitro models to patient-derived samples is not possible. Furthermore, the functional influence of tumor-associated exosomes on normal bladder fibroblasts as part of the tumor microenvironment was investigated. First, the time-dependent uptake of exosomes from invasive (T24) and non-invasive (RT112) urinary bladder cancer cells into normal hTERT-immortalized foreskin fibroblasts was demonstrated by fluorescence labeling. Exosomes were rapidly and effectively internalized within 6 h, which was independent from the invasiveness of parental urinary bladder cancer cells. The exosomes were processed within 48 h. Furthermore, for the first time it could be demonstrated that urinary bladder cancer cells were able to transport miRNAs (cel-miR-39- 3p) via exosomes to other cells (normal hTERT-immortalized foreskin fibroblasts; tumorassociated fibroblasts). A correlation between miRNA expression and the used amount of exosomes could be proved independently of the invasiveness of parental urinary bladder cancer cells. The last aim of this thesis was the analysis of the functional influence of tumor-associated exosomes on tumor-promoting processes (proliferation; migration) in normal bladder fibroblasts. After successful establishment of proliferation assay using normal hTERTimmortalized foreskin fibroblasts, the ability of proliferation and migration after stimulation with tumor-associated exosomes was analyzed. Exosomes secreted by normal bladder cells induced a significant increase of proliferation of bladder fibroblasts compared to unstimulated cells, but did not affect the migration ability of recipient cells. The proliferation and migration of bladder fibroblasts was affected independently from the invasiveness of parental cells, but in a cell-specific manner compared to normal exosomes. Generally, both processes were stimulated whereby mainly exosomes of the cell line RT112 lead to these effects. The cellspecific influence was independent from the time of stimulation and for proliferation also independent from the used amount of exosomes. Exosomes secreted by urinary bladder cancer cells affect tumor-promoting processes in tumor microenvironment cells whereby the tumor progression and metastasis can facilitated. The underlying mechanisms and molecules of this were not investigated in this thesis. Based on the results of this thesis, further analyses will have to study the role of exosomal components in the interaction of bladder cancer and fibroblasts. The resulting knowledge about the intracellular and extracellular signaling pathways of the urinary bladder cancer could lead to a better understanding of the tumorigenesis, progression and metastasis of urinary bladder cancer resulting in an individual assessment of prognosis and therapy options as well as in the development of new targeted drugs.