Retinoic Acid Signaling during Homeostatic Synaptic Plasticity

Abstract

The mammalian brain is composed of billions of neurons that build functional units by forming multiple and complex connections to constitute neuronal networks. Synapses are the specialized structures through which neurons connect. The remarkable ability of the brain to analyze and generate appropriate responses to an animal’s ever-changing envi-ronment is based on its power to reshape synaptic connections. Such changes of synaptic connections and neuronal network connectivity, termed synaptic and network plasticity, respectively, are seen as biological correlates of learning and memory, and deciphering their molecular mechanisms may help to understand the function of the brain as a whole. HEBBian plasticity is a feed-forward mechanism whereby strongly activated synaptic connections get even further strengthened. Therefore, a biological feed-back loop termed homeostatic synaptic plasticity (HSP), acts as a natural regulator to avoid excessive strengthening of very active connections at the expense of less active ones. Our lab de-monstrated previously that all-trans retinoic acid (RA) acts as a central signaling molecu-le during HSP. In the present study, we wanted to ask where and when RA is active du-ring HSP, and find or develop suitable bioreporter methods to address these questions. We first focused on transcription-based reporters that exploit RA’s ability to bind to cellular RA receptors (RARs) and thereby activate transcription of specific genes. Our previously used transcription-based reporter contains a green fluorescent reporter gene (GFP) driven by a weak promoter (TK promoter) that is regulated by a RA response ele-ment (RARE-TK::GFP). This reporter suffers from a small dynamic range and allows RA detection only within a very short time window before getting saturated. We developed an improved reporter based on the yeast transcription factor Gal4 and its DNA binding se-quence “upstream activating sequence” (UAS) which are both foreign to mammalian cells and thereby reduce chances of undesired cellular regulation of the reporter. Our novel de-sign utilizes a chimeric receptor composed of the Gal4 DNA-binding domain (Gal4-DBD) and a ligand-binding domain from one of three different RARs (RAR-LBD), as well as a firefly luciferase and enhanced GFP reporter fusion gene (fLuc-EGFP) ex-pressed by a weak promoter (E4TATA) located downstream of a UAS (UAS-E4TATA::fLuc-EGFP). The chimeric Gal4-RAR receptor bound to the UAS can enhance transcription only in the presence of RA. We show that this reporter design overcomes the limitations of our previously used RARE-TK::GFP reporter and faithfully detects RA production in transfected neurons after several days of reporter expression. The stable responsiveness of the improved reporter is prerequisite for its utility for in vivo applications which rely on viral reporter delivery and long-term expression. We also show with both our previous and improved reporters that blocking calcineurin activity in dissociated hippocampal neu-ron cultures is sufficient to induce cellular RA production, suggesting that calcineurin is the critical calcium sensor that senses and relates synaptic activity levels to RA produc-tion within the HSP signaling cascade. We next wanted to develop a method to directly indicate the presence of RA with high spatial and temporal resolution. We designed a modular sensor protein that would allow the detection of conformational changes by measurements of FÖRSTER resonance energy transfer (FRET). We fused the RAR-LBD to a NR box, a specific peptide motif which can bind to the RAR-LBD in an RA-dependent manner. This fusion protein is sandwi-ched between cyan (CFP) and yellow fluorescent proteins (YFP), rendering conformatio-nal changes amenable to FRET measurements. The sensor assumes an extended confor-mation in the absence of RA, yielding low FRET efficiency. In the presence of RA, the LBD should recruit the NR box peptide leading to a compact conformation, thus yielding higher FRET efficiency. Despite various modifications of the sensor design, we failed to obtain responsiveness to RA with this method. We obtained a different genetically encoded sensor for RA (aGEPRA) which directly translates the RA-dependent conformational changes of the RAR-LBD into FRET chan-ges. We successfully expressed aGEPRA in dissociated hippocampal neurons and recor-ded FRET changes during pharmacological blockade of synaptic activity. Within two hours of synaptic activity blockade some neurons showed increasing reporter activity (“responders”) while others responded with a decrease (“non-responders”). However, al-most all control cells observed for two hours without synaptic activity blockade behaved like “responders”, hampering the interpretation of our results. We tend to exclude techni-cal reasons and suggest that the lack of signal integration is a central limitation of the aGEPRA FRET sensor, prohibiting the detection of low endogenous RA levels. Last, we tested the utility of ratiometric FRET for 2-photon microscopy. We show that quantitation of ratiometric FRET is feasible with the Clover-mRuby2 FRET pair which exhibits a large separation of the 2-photon excitation spectra between donor and acceptor fluorophores. FRET changes are also qualitatively detectable with aGEPRA even though the spectral overlap between its CFP and YFP fluorophores are spectrally less well re-solved; therefore, thorough calibration of the method would be required to allow for pre-cise absolute FRET quantification. We conclude that only integrating, transcription-based reporters seem to provide suffi-cient sensitivity to detect RA levels produced during HSP. The non-integrating aGEPRA FRET sensor seems to lack the sensitivity required to visualize endogenous neuronal RA levels produced during synaptic activity blockade.

Das Gehirn besteht aus vielen Milliarden Nervenzellen, die komplexe Verbindungen eingehen um neuronale Netzwerke, die funktionellen Einheiten des Gehirns, zu bilden. Synapsen sind spezialisierte Strukturen, mit denen Nervenzellen untereinander Kontakt herstellen. Die Fähigkeit des Gehirns, auf eine sich ständig ändernde Umgebung eines Lebewesens zu reagieren basiert auf der Formbarkeit dieser synaptischen Verbindungen. Solche Veränderungen synaptischer Verbindungen und neuronaler Netzwerke werden synaptische beziehungsweise Netzwerkplastizität genannt, und sie bilden vermutlich die biologische Grundlage des Lernens und Gedächtnisses. Die diesen Prozessen zu Grunde liegenden Mechanismen zu studieren ist unverzichtbar, um die Funktionsweise des Ge-hirns als ganzes verstehen zu können. HEBB’sche Plastizität ist ein Verstärkungsmechanismus, durch den hochaktive Sy-napsen weiter verstärkt werden können. Ein biologischer Regulationsprozess, genannt homöostatische synaptische Plastizität (HSP), wirkt der HEBB’schen Plastizität entgegen und verhindert dadurch eine Überaktivierung stärkerer Verbindungen zu Ungunsten der schwächeren. Wir konnten in früheren Untersuchungen zeigen, dass all-trans Retinolsäu-re (RA) eine zentrale Rolle in der Regulation von HSP spielt. Wir gingen in der vorlie-genden Arbeit der Frage nach, wo und wann RA während der HSP aktiv ist, und testeten oder entwickelten geeignete Methoden zur Untersuchung dieser Fragestellungen. RA kann an zelluläre RA Rezeptoren (RARs) binden und dadurch die Transkription spezieller Gene aktivieren, was man zur Entwicklung transkriptions-basierter Reporter nutzen kann. Unser bislang verwendeter transkriptions-basierter Reporter enthält ein grün fluoreszierendes Reportergen (GFP), das von einem schwachen TK Promoter unter Regu-lation eines RA Responselements exprimiert wird (RARE-TK::GFP). Wir haben einen verbesserten transkriptions-basierten Reporter entwickelt, der auf dem Transkriptionsfak-tor Gal4 und dessen DNA-Bindungsstelle „upstream activating sequence“ aus der Hefe beruht, um den dynamischen Bereich und die zeitliche Nutzbarkeit zu erweitern. Die verwendeten Komponenten kommen in Säugerzellen nicht vor und sollten auch keiner uner-wünschten zellulären Regulation unterworfen sein. Wir nutzen einen chimären Rezeptor bestehend aus der Gal4 DNA-Bindedomäne (Gal4-DBD) und einer RAR Liganden-Bindedomäne (RAR-LBD), sowie eine mit GFP fusionierte Leuchtkäfer-Luciferase als Reportergen (fLuc-EGFP), das von einem schwachen Promoter (E4TATA) hinter einer UAS exprimiert wird (UAS-E4TATA::fLuc-EGFP). Der Gal4-RAR Rezeptor bindet an die UAS und erhöht in Gegenwart von RA die Transkription des Reportergens. Wir zeigen, dass dieses Prinzip unseren vorherigen RARE-TK::GFP Reporter übertrifft, indem ein Nachweis der RA-Produktion noch nach mehrtägiger Reporterexpression gelingt, was eine Anwendung des neuen Reporters durch Virus-vermittelte Gewebsexpression in vivo ermöglicht. Sowohl mit unserem bisherigen als auch dem neu entwickelten Reporter konnten wir eine RA-Produktion in Nervenzellen zeigen, in denen Calcineurin pharmako-logisch inhibiert wurde. Wir schließen daraus, dass Calcineurin der Calcium-Sensor ist, der synaptische Aktivität über die Calcium-Konzentration erkennt und auf dieser Grund-lage die RA-Produktion während der HSP regulieren kann. Zum Nachweis von RA mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung entwickelten wir einen modularen Sensor, dessen Konformationsänderungen wir durch FÖRSTER Reso-nanz-Energietransfer (FRET) sichtbar machen können. Wir fusionierten die RAR-LBD mit einer NR Box - einer spezifischen Peptidsequenz, die RA-abhängig an die LBD bin-den kann. Anfügen von cyan (CFP) und gelbem Fluoreszenzprotein (YFP) an das NR Box-LBD Fusionsprotein sollte dessen Konformationsänderungen durch FRET messbar machen: Eine in Abwesenheit von RA gestreckte Sensorkonformation zeigt wenig FRET, während die NR Box in Gegenwart von RA an die LBD binden und eine geschlossene Konformation herbeiführen sollte, was eine höhere FRET-Effizienz bewirken würde. Trotz zahlreicher getesteter Modifikationen des Sensors gelang uns mit dieser Methode kein Nachweis RA-abhängiger Konformationsänderungen. aGEPRA ist ein anderer FRET-basierter RA Sensor, der den Konformationswechsel der RAR-LBD direkt in eine Änderung des FRET-Signals übersetzt. Wir konnten diesen Reporter in Nervenzellen exprimieren und FRET-Signale über zwei Stunden während ei-ner pharmakologischen Blockade synaptischer Aktivität messen. Während der Blockade zeigten einige Zellen ein steigendes („Responder“), und andere ein abfallendes Reporter-signal („Non-Responder“). Die meisten Kontrollzellen, deren synaptische Aktivität nicht blockiert wurde, verhielten sich jedoch allgemein ähnlich den „Responder“ Zellen, ob-wohl in Kontrollzellen keine RA-Synthese stattfinden sollte. Diese Ergebnisse sind wahr-scheinlich nicht technisch bedingt, sondern womöglich auf eine mangelnde Sensitivität des aGEPRA FRET Sensors zurückzuführen, da er das Signal nicht zeitlich oder räumlich integrieren und folglich sehr niedrige RA-Konzentrationen nicht anzeigen kann. Wir testeten zuletzt, in wieweit ratiometrische FRET-Messungen mit 2-Photonen-Mikroskopie erfasst werden können und stellen fest, dass quantitative Messungen für FRET-Paare mit hinreichender spektraler Separation ihrer 2-Photonen-Anregungsspek-tren möglich sind, wie wir anhand des Clover-mRuby2 FRET-Paares zeigen. FRET-Änderungen sind auch bei FRET-Paaren mit weniger deutlicher spektraler Auftrennung der Fluorophore zumindest qualitativ messbar, wie bei aGEPRA mit seinem CFP-YFP FRET-Paar; eine absolute Quantifizierung kann in solchen Fällen jedoch nur bei sorgfälti-ger Kalibrierung der Methode gelingen. Wir ziehen den Schluss, dass nur integrierende Reporter eine hinreichende Sensitivität liefern, um niedrige RA-Konzentrationen während der HSP zu erfassen. Dem nicht-integrierenden aGEPRA FRET Sensor mangelt es hingegen an Sensitivität, um endogene RA-Produktion darzustellen, wie sie während der Blockierung synaptischer Aktivität in Nervenzellen aktiviert wird.