Microparticles – A novel liquid biopsy tool to identify and classify primary hepatic cancer

Abstract

The liver is the fifth most frequent tumor site worldwide, and importantly liver tumors are accompanied by a poor prognosis and short life expectancy. Primary hepatic cancer is divided into several types depending on their origin, including hepatocellular carcinoma, originates from hepatocytes and cholangiocarcinoma, which starts in intrahepatic bile ducts. In diagnosis of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma, serum markers and various imaging modalities play a crucial role. However, diagnostic potential is limited, particularly in monitoring of patients at risk to develop a tumor. Liquid biopsies examine tumor-derived cells, DNA, microRNA or extracellular vesicles circulating in the vasculature, what could possibly be used to detect cancer at an early stage to improve the prognosis. Microparticles, a subtype of extracellular vesicles, are shed by membrane budding and thereby contain surface markers from the cell of origin. Thus, examining these vesicles using specific marker combination may allow identifying the origin of circulating microparticles. Due to different surface markers profiles, previous studies showed disease-specific expansion of various microparticle populations in patients with chronic hepatitis C and non-alcoholic fatty liver disease as well as in tumor-bearing patients. This study addresses the hypothesis that microparticles carry origin-dependent individual surface marker profiles and therefore could serve as novel liquid biopsy tool. Thus, the aim of this study was to examine the diagnostic potential of liver- and liver tumor-derived microparticles, isolated from human sera, in diagnosis of hepatic cancer, particularly hepatocellular- and cholangiocarcinoma. A surface marker panel suitable for flow cytometry analysis, included AnnexinV, EpCAM, CD133, ASGPR1 and gp38, was first explored in human cancer cell lines and within the murine hepatic progenitor compartment and finally was evaluated by microparticle profiling in healthy controls and patients bearing cirrhosis, hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma, colorectal-, non-small cell lung- and pancreatic cancer. AnnexinV+EpCAM+ microparticles were increased in sera of patients with cirrhosis and various cancer entities, albeit with moderate diagnostic potential (over 50 % in sensitivity, specificity, positive- and negative prediction value). Despite, this data suggest this microparticle population as a pan-cancer marker. Furthermore, the marker combination of AnnexinV+EpCAM+CD133+ and AnnexinV+EpCAM+CD133+ASGPR1+ corresponds to liver disorder-associated microparticles and only expand in patients with cirrhosis, hepatocellular- and cholangiocarcinoma, resulting in 73 to 83 % sensitivity, 50 % specificity and 81 to 83 % positive prediction value. Additionally, AnnexinV+EpCAM+ASGPR1+ microparticles discriminate patients with liver disorders in malignancies (hepatic cancer) and non-malignancies (cirrhosis) with solid diagnostic potential (75 % sensitivity and 78 % positive prediction value.). Notably, this subpopulation does not only correlate with the liver tumor load, but values drop after tumor resection and thus suggest a strong dependency on tumor presence. Importantly, with this approach, 64 % of patients with liver disorders and 54 % of patients with primary hepatic cancers were identified correctly. Moreover, AnnexinV+gp38+CD133+ and AnnexinV+EpCAM+gp38+CD133+ microparticles expand in patients with cholangiocarcinoma and therefore classification of primary hepatic cancer between hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma is feasible and results in moderate diagnostic potential (68 to 82 % sensitivity, 55 to 67 % specificity and 55 to 58 % positive prediction value). Nonetheless, using these marker combinations, 59 % of patients with cholangiocarcinoma and 52 % of patients with hepatocellular carcinoma could be correctly identified. Taken together, microparticle profiling enables the detection of primary hepatic cancer and thus distinguishing hepatocellular- and cholangiocarcinoma. However, this method needs further exploration and likely be used in addition to conventional methods of liver cancer diagnosis, particularly in patients at risk to develop primary hepatic cancer to improve cancer detection at an early stage.

Die Leber gehört weltweit zu den fünfthäufigsten Tumorentitäten und ist gezeichnet von einer schlechten Prognose und geringer Lebenserwartung. Es gibt je nach Ursprung verschiedene Typen des primären Leberkarzinoms. Hierzu gehören zum einen das Leberzellkarzinom, mit seinem Ursprung in Hepatozyten und zum anderen das Cholangiokarzinom, welches in intrahepatischen Gallengängen beginnt. Bei der Diagnose des Leberzell- und Cholangiokarzinoms spielen Tumormarker und verschiedene bildgebende Verfahren eine entscheidende Rolle. Jedoch ist das diagnostische Potential limitiert, vor allem bei Risikopatienten. „Liquid Biopsies“ untersuchen tumorabstammende Zellen, DNA, microRNA oder extrazelluläre Vesikel, die im Gefäßsystem zirkulieren. Diese könnte möglicherweise verwendet werden, um ein Karzinom im frühen Stadium zu erkennen und so eine bessere Prognose zu ermöglichen. Mikropartikel gehören zu der Klasse der extrazellulären Vesikel und werden durch Membranknospung freigesetzt, wodurch sie die Oberflächenmarkern ihrer Ursprungszelle erhalten. Dies könnte genutzt werden um mittels spezifischer Markerkombinationen den Ursprung der zirkulierenden Mikropartikel zu identifizieren. Basierend auf verschieden Oberflächenmarkern haben Studien gezeigt, dass verschiedene Mikropartikelpopulationen krankheitsspezifisch in Patienten mit chronischer Hepatitis C und nicht-alkoholischer Fettleber, sowie auch bei Tumorpatienten mit unterschiedlichen Tumorentitäten vermehrt vorkommen. Darauf basierend befasst sich diese Studie mit der Hypothese, dass Mikropartikel herkunftsabhängig individuelle Oberflächenmarker tragen und somit als neue „Liquid Biopsy“-Methode genutzt werden können. Ziel dieser Studie war daher die Untersuchung des diagnostischen Potentials von leber- und lebertumorabstammenden zirkulierenden Mikropartikeln, isoliert aus humanen Seren, bei der Diagnose des primären Leberkarzinoms bzw. von Leberzell- und Cholangiokarzinom. Eine für die Durchflusszytometrie geeignete Auswahl an Oberflächenmarkern, einschließlich AnnexinV, EpCAM, CD133, ASGPR1 und gp38, wurde zunächst an humanen Zelllinien und Subpopulationen muriner hepatischer Vorläuferzellen untersucht und anschließend bei der Untersuchung von Mikropartikelprofilen in gesunden Probanden und Patienten mit Zirrhose, Leberzell-, Cholangio-, Kolon-, nichtkleinzelligem Bronchial- und Pankreaskarzinom evaluiert. AnnexinV+EpCAM+ Mikropartikel scheinen generell ein Marker für die Tumorerkennung zu sein, da diese hauptsächlich vermehrt in Patienten mit Zirrhose oder Tumoren vorkommen. Jedoch zeigt diese Population nur ein mäßiges diagnostisches Potential mit jeweils über 50 % im Bezug auf Sensitivität, Spezifität, positiven und negativen Prädiktivem Wert. Des Weiteren scheinen Annexin+EpCAM+CD133+ und Annexin+EpCAM+CD133+ASGPR1+ Mikropartikel spezifisch Lebererkrankungen zu detektieren, da sie speziell in Patienten mit Zirrhose und primären Leberkarzinom vermehrt vorkommen und in 73 bis 83 % Sensitivität, 50 % Spezifität, und 81 bis 83% positiven Prädiktivem Wert resultierten. Zusätzlich ermöglichen Annexin+EpCAM+ASGPR1+ Mikropartikel die Unterscheidung in nicht-maligne (Zirrhose) und maligne (primärer Leberkrebs) Lebererkrankungen mit einem guten diagnostischen Potential (75 % Sensitivität und 78 % positiven Prädiktivem Wert). Bemerkenswerterweise besteht eine Korrelation zwischen Annexin+EpCAM+ASGPR1+ Mikropartikeln und der Tumorlast, sowie auch mit der Tumorpräsenz, aufgrund abnehmenden Mikropartikelwerte nach Tumorresektion. Mit Hilfe dieser Mikropartikelpopulationen konnten 64 % der Patienten mit Lebererkrankungen und 54 % der Patienten mit primären Leberkarzinom richtig identifiziert werden. Darüber hinaus zeigen Annexin+gp38+CD133+ und Annexin+EpCAM+gp38+CD133+ Mikropartikel hauptsächlich ein gehäuftes vorkommen in Patienten mit Cholangiokarzinom, wodurch mutmaßlich eine Klassifizierung des primären Leberkarzinoms in Leberzell- und Cholangiokarzinom, mit einem guten diagnostischen Potential, möglich ist (68 bis 82 % Sensitivität, 55 bis 67 % Spezifität, und 55 bis 58% positiven Prädiktivem Wert). Schließlich konnten 59 % der Patienten mit einem Cholangiokarzinom und 52 % der Patienten mit Leberzellkarzinom als diese identifiziert werden. Daraus resultiert, dass mittels verschiedener Mikropartikelprofile die Detektion des primären Leberkarzinoms und insbesondere eine Klassifizierung in Leberzell- und Cholangiokarzinom ermöglicht wird. Jedoch bedarf diese Methode weiterer Untersuchungen und könnte zusätzlich zu den konventionellen Methoden der Leberkrebsdiagnostik Anwendung finden, besonders bei Risikopatienten um die Krebsdetektion in einem früheren Stadium zu verbessern.