Association between aberrations in DNA methylation patterns of spermatozoa and abnormalities in semen parameters of subfertile males

Abstract

Infertility affects 10 15% of couples and approximately 50% of cases are linked to male factor infertility. In recent decades, many studies have found that genetic causes, aberrant patterns of DNA methylation and histone modification have been shown to play a role in male infertility or fecundity decline, and have been identified in 15 30% of infertile males. Besides, several studies have illustrated that changes in the DNA methylation of specific genes in germ cells are linked with oligozoospermia, reduced progressive sperm motility, and abnormal sperm morphology. Likewise, a recent study detected aberrant in DNA methylation levels for genes involved in the spermatogenic program and located outside of imprinted regions in poor quality spermatozoa. The present thesis aimed (I) to determine whether sperm DNA methylation level at CpG dinucleotides is different in males suffering from a reduction in fecundity compared to proven fertile males, (II) to determine the relationship between changes in sperm DNA methylation levels in this gene and abnormalities in semen parameters, (III) to identify whether cigarette smoking alters sperm DNA methylation patterns and to determine whether this alteration in sperm DNA methylation is associated with basic semen parameters like sperm count, sperm motility, and morphology, (IV) to evaluate the association between the gene expressions level for the genes included in this study and semen parameters, addition to assessing the correlation between the gene expression and the alteration in spermatozoa DNA methylation levels. The strategy of this research was applied as the following: Infinium 450K BeadChip array was used as screening study, to evaluate the variation in sperm DNA methylation levels between cases and controls groups. Then the differentially methylated CpGs (DMC) underwent to deep bisulfite sequencing to validate on large cohort samples (as validation study). In the end, Quantitative RT-PCR assay was used to evaluate the expression of the gene included in this study. According to the results of the validation study, the bioinformatics analysis found that more than one CpG showed a difference in the methylation level addition to CpGs obtained from the screening study between subfertile males and proven fertile males. Some of this CpGs were located in gene bodies and CpG islands (PRICKLE2, ALS2CR12, ALDH3B2, PTGIR, KCNJ5, MLPH, SMC1b, GAA, PRRC2A, MAPK8/P3, PDE11A, ANXA2, CGß, and TYRO3), while the other CpGs were located in intergenic regions. Besides, a significant correlation was found between the methylation levels at the CpGs in genes related amplicon of subfertile males and semen parameters like sperm count, a percentage of total sperm motility, the percentage of progressive motility, a percentage of nonprogressive motility, a percentage of immotile sperm and sperm vitality. On the other hand, this study showed more than one CpGs have significant differences in methylation levels between current smokers as compared to never smoked males like CpGs namely cg07869343 and cg19169023, which are located in the MAPK8IP3 and TKR genes. Moreover, the results showed a significant correlation between the methylation levels at more than one CpGs in the genes related amplicon of current smoker males and semen parameters such as sperm count, the percentage of total sperm motility, a percentage of sperm immotile, a percentage of progressive motility, and a percentage of sperm normal form. In conclusion, this study identified CpGs related to different genes have an alteration in sperm DNA methylation levels in cases compared to controls groups. In addition, an association between changes in the methylation level for these CpGs and different semen parameters was found. The observed variations may have an influence on sperm phenotype. More studies are needed to clarify the mechanisms relating to these alterations and to discover their significance and functional consequences for male fecundity

Unfruchtbarkeit betrifft 10 - 15% der Paare und etwa 50 % der Fälle werden an männliche Faktorunfruchtbarkeit verbunden. In den letzten Jahrzehnten haben viele Studien haben festgestellt, dass die genetische Ursachen, abweichendes Muster der DNA-Methylierung und Histonmodifikation gezeigt haben, eine Rolle in der männlichen Unfruchtbarkeit oder Fruchtbarkeit Rückgang zu spielen, und haben in 15 identifiziert wurde - 30% der infertile Männer. Neben, mehrere Studien haben gezeigt, dass die Veränderungen in der DNA-Methylierung spezifischer Gene in Keimzellen verbunden sind mit oligozoospermie, reduzierte progressive Beweglichkeit der Spermien, die Morphologie der Spermien und abnormal. Ebenso wird eine aktuelle Studie entdeckt aberrante DNA-Methylierung von Genen, die in die spermatogene programm beteiligten und außerhalb der geprägten Regionen in schlechter Qualität der Spermien. Die vorliegende Arbeit soll (I), um zu bestimmen, ob die Spermien-DNA Methylierung bei CpG dinucleotides verschiedenen in Männer leiden unter einer Verringerung der Fruchtbarkeit ist im Vergleich zu den bewährten fruchtbare Männer, (II) die Beziehung zwischen Veränderungen der Spermien-DNA Methylierung Ebenen in diesem Gen und Missbildungen im Samen Parameter zu bestimmen, (iii) um zu ermitteln, ob das Rauchen verändert Spermien-DNA Methylierungsmuster und zu ermitteln, ob diese Änderung der Spermien-DNA Methylierung mit grundlegenden Samen Parameter wie die Zahl der Spermien, die Beweglichkeit der Spermien zugeordnet ist, und die Morphologie, (iv) die Assoziation zwischen den gen Ausdrücke für die Gene, die in dieser Studie und Samen Parameter enthalten, zusätzlich zu der Bewertung der Korrelation zwischen der Genexpression und der Veränderung der Spermien-DNA-Methylierung. Die Strategie dieser Forschung war, wie die Folgenden: Infinium 450K BeadChip Array war als screening Studie verwendet, die Veränderung der Spermien-DNA Methylierung Ebenen zwischen Fällen und Kontrollen Gruppen zu bewerten. Dann die differentiell methylierte CpGs (DMC) wurde zu tief Bisulfite Sequencing auf große Kohorte Proben (als validierungsstudie) bestätigen. Am Ende, Quantitative RT-PCR Assay wurde verwendet, um die Expression des Gens in dieser Studie zu bewerten. Nach den Ergebnissen der Validierungsstudie, die bioinformatik Analyse ergab, dass mehr als ein CpG zeigten einen Unterschied in der methylierung Ebene neben der CpGs vom screening Studie zwischen subfertile Männer und bewährte fruchtbare Männer gewonnen. Einige dieser CpGs wurden in gen Stellen und CpG-Inseln (KRIBBELN 2, ALS 2 CR 12, ALDH3 B2, PTGIR, Kcnj 5, MLPH, SMC 1b, GAA, PRRC2A, MAPK 8 IP3, PDE11A, ANXA2, CGß und TYRO3), während die anderen CpGs in intergenic Regionen entfernt wurden. Außerdem wurde eine signifikante Korrelation zwischen der Methylierung der CpGs in Genen amplikon der Subfertile Männer und Samen Parameter wie die Zahl der Spermien gefunden wurde, einen Prozentsatz der gesamten Beweglichkeit der Spermien, der Prozentsatz der Spermienbeweglichkeit, ein Anteil von Nicht-progressive Motilität, einen Prozentsatz der Immotile Spermien und Spermien Vitalität. Auf der anderen Seite ist diese Studie zeigte mehr als ein CpGs haben signifikante Unterschiede in der Methylierung Ebenen zwischen Rauchern gegenüber nie geraucht Männchen wie CpGs nämlich cg cg 07869343 und 19169023, die in der Mapk 8 IP3 und TKR Gene befinden. Darüber hinaus. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Methylierung Niveaus an mehr als einem CpGs in den Genen amplikon der aktuellen Raucher Männer und Samen Parameter wie die Zahl der Spermien, der Prozentsatz der gesamten Beweglichkeit der Spermien, einen Prozentsatz der Spermien Immotile, einen Prozentsatz der Spermienbeweglichkeit und ein Prozentsatz der Spermien normale Form an. Im Ergebnis dieser Studie identifizierten CpGs im Zusammenhang mit verschiedenen Genen haben eine Veränderung in der Spermien-DNA Methylierung Ebenen in Fällen verglichen mit Kontrollen Gruppen. Zusätzlich wird eine Verbindung zwischen den Veränderungen in der Methylierung für diese CpGs und verschiedenen Samen Parameter gefunden wurde. Die beobachteten Abweichungen können einen Einfluss auf die spermien Phänotyp. Weitere Studien sind notwendig, um die Mechanismen, die im Zusammenhang mit diesen Veränderungen und deren Bedeutung und funktionelle Konsequenzen für männliche Fruchtbarkeit zu entdecken, zu klären.