Differential loading of the Argonaute complex in Epstein-Barr Virus (EBV)-infected cell lines derived from diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL)

Abstract

MicroRNAs sind essentielle post-transkriptionelle Regulatoren der Genexpression die an unterschiedlichen Prozessen wie Entwicklung, Signaltransduktion oder Wachstumskontrolle durch Bindung und Inhibition der Translation ihrer mRNA Ziel mRNAs beteiligt sind. Obwohl angenommen wird, dass ihre relative Expression in der Zelle das Ausmaß ihrer biologischen Funktion bestimmt, zeigt die Beladung der „Argonaute“ (Ago)-mRNA Komplexe mit miRNAs deren Relevanz besser an. In der vorliegenden Arbeit wurde die miRNA Beladung der Ago-Komplexe mit den miRNA Profilen der Gesamt-RNA zweier diffus-großzelliger B-Zell Lymphome (DLBCL) Linien nach Epstein-Barr Virus (EBV) -Infektion, verglichen. DLBCL ist ein hochmaligner Tumor, welcher in Aktivierte B-Zell (ABC-) und Germinal Center B-Zell (GCB-) DLBCL unterschieden wird. Etwa 10% aller DLBCLs sind mit dem onkogenen EBV, welches selbst 44 reife miRNAs exprimiert, infiziert. Die miRNA Profile aus Gesamtzellextrakten und des Ago2-Profils zweier DLBCL Linen wurden durch Hochdurchsatzsequenzierung (RNA-Seq) analysiert. In den Gesamt-Profilen konnten zwischen 713-851 humane miRNAs identifiziert werden, während die Ago2-Profile 1102-1372 humane miRNAs ergaben. Bei Anwendung eines 0.1% „cut-offs“ verringerte sich die Zahl der funktionellen miRNAs auf 56-62., welche jedoch immer noch 92-95% aller miRNAs-reads ausmachten. In Abhängigkeit von Latenztyp repräsentierten die viralen miRNAs 1.6% - 28% aller „reads“. In beiden Zelllinien hatte die EBV-Infektion den Verlust von miRNAs im Ago2-Komplex zur Folge. Die erhobenen Daten konnten für ausgewählte miRNAs durch RT-qPCR und im Northern Blot bestätigt werden. Auch die Analyse der Ago2-Komplexe der einzelnen Zellen ergab eine auffällige Umverteilung miRNAs zwischen Gesamt- und Ago2-assoziierten miRNAs. Zum Beispiel war die miRNA miR-423 in allen Zellen 6-8-fach im Ago2-Komplex angereichert, während die miR-142 im Ago2-Komplex depletiert vorliegt , was auf einen Funktionsverlust hinweist. Die hier erhobenen Daten werden zum weiteren Verständnis des Beitrags von miRNAs bei der Entstehung und Aufrechterhaltung von DLBCLs leisten.

MicroRNAs are important post-transcriptional regulators of gene expression in all eukaryotic cells and play essential roles, i.e. in development, signal transduction or growth control by binding to and inhibiting the translation of their mRNA targets. While it is widely assumed that their overall level in a cell reflects their functional relevance, the loading and transfer of miRNAs to the “Argonaute” (Ago)-mRNA complex appears to give a more accurate indication of their activity in a cell. In this thesis, the miRNA loading of the Ago complex was compared with the total cellular miRNA profile of two cell lines derived from diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) in comparison with their Epstein-Barr Virus infected counterparts. DLBCL is a highly malignant tumor subdivided into Activated B-cell (ABC-) and Germinal Center B-cell (GCB-) subtypes. About 10% of DLBCL are infected with the oncogenic Epstein-Barr virus which itself encodes 44 mature miRNAs. The cellular and Ago2-bound miRNAs in two DLBCL lines were subjected to ultra-deep sequencing (RNA-seq). In the total profiles, 713-851 human miRNAs were detected while the Ago2-immunoprecipitation (Ago2-IP) resulted in 1102-1372 different miRNAs. When a 0.1% cut-off was applied which is considered to yield the functionally relevant miRNAs, only between 56-62 miRNAs were left. These, however, represented 92-95% of all reads. In the two EBV-infected counterparts, EBV-miRNAs represented between 1.6% - 28% of all reads depending on the viral latency type. In the case where EBV miRNAs accounted for 28 % of total reads cellular miRNAs were replaced from the Ago2-complex. The results could be confirmed for selected miRNAs by RT-qPCR and Northern blotting. Also within each cell line, various miRNAs were enriched or depleted from the Ago2 complex. For instance, mir-423-5p and mir-423-3p were highly enriched, by over 6-8-fold in Ago2-IP, compared to total cellular profile in all cell lines while miR142 was strongly depleted from the Ago2-complex indicating a functional loss in DLBCL. The data obtained will help to further understand the contribution of cell and viral miRNAs in induction and maintenance of DLBCL.