Beurteilung der Spermienqualität, insbesondere nukleärer und mitochondrialer DNA nach mehreren Einfrier- und Auftauzyklen.

Abstract

Laut Daten des Deutschen IVF Registers wurden bis heute mehr als 5 Millionen Kinder weltweit mithilfe reproduktionsmedizinischer Verfahren zur Welt gebracht. Die Reproduktionsmedizin entwickelt weiterhin neue Techniken und Methoden, um bessere Ergebnisse in der Kinderwunschbehandlung zu erzielen. Denn die Anzahl an ungewollt kinderlosen Paaren ist in Deutschland und auf der ganzen Welt unverändert hoch. Auch die Rate an Tumorerkrankungen, wie beispielsweise Hodenkrebs und andere Erkrankungen, die mit einer reduzierten Spermienqualität einhergehen, sind längst Teil des klinischen Alltags. Diesen Patienten und vielen mehr kann die heutige Medizin helfen, ihr Wunschziel (ein Kind zu bekommen) zu erreichen. Ein wichtiger Bestandteil, vor allem im Hinblick auf die „Haltbarmachung“ der Spermien, ist und bleibt die Kryokonservierung. Wie bereits durch viele vorhergehende Studien bekannt ist, kommt es durch die Kryokonservierung zur negativen Beeinflussung von Spermienparametern. In der vorliegenden Studie wurde der Einfluss der Kryokonservierung auf das Überleben der Spermien und die einzelnen Spermienparameter untersucht. Außerdem wurde geprüft, inwiefern diese Parameter miteinander assoziiert sind. Dafür wurden insgesamt 40 Spermienproben gesammelt und insgesamt fünfmal eingefroren und wieder aufgetaut, um einen möglichen „Trend“ der einzelnen Parameter besser beurteilen zu können. An der vorliegenden Studie nahmen insgesamt 40 freiwillige Probanden im Alter von 20 bis 44 Jahren teil, deren Ejakulat nach Standards der Weltgesundheitsorganisation (WHO) auf Gesamtspermienzahl, Motilität, Vitalität und Morphologie untersucht wurde. Zusätzlich wurde der Body-Mass-Index (BMI) der Probanden, die Leukozytenzahl und das Vorhandensein von Spermienantikörpern im Ejakulat bestimmt. Eine mögliche Schädigung der nukleären Desoxyribonukleinsäure (DNA) wurde per Tunel (terminal desoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated dUTP nick end labeling-) Test geprüft. Die mitochondriale, intrinsisch ausgelöste Apoptose wurde durch den Anteil der Expression von Caspase 3 (Antibody to Active Caspase 3 FITC Detection Kit) beurteilt. Die Tests wurden nativ und nach jedem Gefriervorgang durchgeführt. Die Gesamtmotilität betrug nativ im Mittel 70 %, nach dem fünften Gefriervorgang lag die Motilität bei durchschnittlich 0 %. Die Messung der Vitalität zeigte nativ 66,5 %, nach dem letzten Gefriervorgang 3 % vitale Spermien. Die abnormale Morphologie nimmt leicht von nativ 95,9 % auf 98,3 % zu. Ebenso kommt es zur Zunahme der DNA-Fragmentierung, von 22,04 % nativ, auf 67,58 %. Die mitochondriale Apoptose erfährt einen Zuwachs von nativ 7,8 % auf 45,25 % nach dem letzten Gefriervorgang. Außerdem bestehen ausgeprägte Zusammenhänge der einzelnen Spermienparameter die mithilfe einer verallgemeinerten Schätzgleichung ermittelt wurden. Wichtig ist hierbei zu beachten, dass die ermittelten Zusammenhänge der Parameter stets über die Zeit mehrerer Gefrier- und Auftauvorgänge bestehen. Zur besseren Übersicht wird dies in einer Tabelle dargestellt: Abhängige Variable Positiver Zusammenhang Negativer Zusammenhang Motilität Gesamtspermienzahl, Vitalität Abnormale Morphologie, DNAFragmentierung, mitochondriale Apoptose Vitalität Gesamtmotilität Abnormale Morphologie Abnormale Morphologie DNA-Fragmentierung, mitochondriale Apoptose Motilität, Vitalität DNA-Fragmentierung Abnormale Morphologie, mitochondriale Apoptose Gesamtspermienzahl, Motilität, Vitalität Mitochondriale Apoptose Abnormale Morphologie, DNA-Fragmentierung Gesamtspermienzahl, Motilität, Vitalität Tabelle 8 Zusammenhänge der Spermienparameter Weitere Einflussfaktoren auf die Resistenz der Spermien stellen in unserer Studie das Alter und der BMI dar. Die DNA-Fragmentierung und die mitochondriale Apoptose zeigen einen positiven Zusammenhang mit dem Alter der Probanden. Außerdem konnte eine positive Assoziation zwischen BMI und Gesamtmotilität beobachtet werden. Ein höheres Auftreten von Antikörpern scheint keinen Einfluss auf die Resistenz der Spermien zu haben. Insgesamt kann eine deutliche Verschlechterung der Spermienparameter durch die wiederholte Kryokonservierung festgestellt werden. Es kommt zur exponentiellen Abnahme der Gesamtmotilität und der Spermienvitalität. Diese Werte scheinen am anfälligsten für die Schädigung durch das Einfrieren. Außerdem kommt es zur linearen Zunahme der abnormalen Morphologie, der DNA-Fragmentierung und der mitochondrialen Apoptose. Es sind noch weitere Studien und Forschung nötig, um die entstandene Schädigung der Spermien weitestgehend gering zu halten. Insbesondere die Protektion von Motilität und Vitalität der Spermien könnte bei zukünftigen Studien im Vordergrund stehen, da diese beiden Parameter besonders stark durch die Kryokonservierung beeinflusst werden.

For many years, medicine is in search of new methods and technologies improving the results of the artificial reproductive technology. The number of couples, who can’t have children despite their wish, is unchanged high. There can be a reduction of sperm quality without an underlying medical condition. Next to that, especially malignant diseases, which need chemotherapy, can be the cause of infertility. A very important part for the “preservation” of sperm for the artificial reproduction is the cryoconservation. Discussed in previous studies, cryoconservation has a negative influence on sperm quality. The aim of this study was to assess the influence of cryoconservation on different sperm parameters and whether they are related to each other or not. For this purpose, the sperm was frozen and thawed five times. 40 healthy men, between 20 and 44 years, participated in this study. The total sperm count, motility, vitality and morphology were determined following the standards of the World Health Organization (WHO). The presence of leukocytes and sperm antibodies in the ejaculate was documented, as well as the body mass index (BMI) of the test persons. The sperm was tested with the Tunel (terminal desoxynucleotidyl transferase (TdT) mediated dUTP nick end labeling)-test in order to assess DNA fragmentation. The mitochondrial induced apoptosis was measured by caspase 3 (Antibody to Active Caspase 3 FITC Detection Kit). The tests were performed native and after each freezing cycle. The total native motility was 70 % on average. After the fifth freezing cycle, there were 0 % motile sperms left. The sperm vitality decreased from native 66,5 % to 3 %. There was a slight increase in the abnormal sperm morphology from 95,9 % on average to 98,3 %. There was an increase of the DNA fragmentation from native 22,04 % positive sperms on 67,58 %. The mitochondrial induced apoptosis increased from native 7,8 % to 45,25 %. Whether the single sperm parameters were related to each other or not, was analyzed by the generalized estimating equation (GEE) - analysis. The results were documented in a table to get a better overview: dependent variable positive association negative association motility total sperm count, vitality abnormal morphology, DNA fragmentation, mitochondrial induced apoptosis vitality motility abnormal morphology abnormal morphology DNA fragmentation, mitochondrial induced apoptosis motility, vitality DNA fragmentation abnormal morphology, mitochondrial induced apoptosis total sperm count, motility, vitality mitochondrial induced apoptosis abnormal morphology, DNA fragmentation total sperm count, motility, vitality Table 8 Associations between sperm parameters We figured out age as a negative influence factor for the test results of the Tunel test and the caspase 3 after cryoconservation. The BMI of the test persons is positively associated with the sperm motility over the time. There was no link between the Mixed Antiglobulin Reaction Test (MAR) and other sperm parameters. Overall there was a deterioration of all sperm parameters over the five freezing cycles. We could see an exponential decrease of sperm motility and vitality. Our data suggest that these two parameters are particularly vulnerable to freezing. There is a linear increase of DNA fragmentation and apoptosis over the five freezing cycles and we observed a slight linear increase of abnormal sperm morphology over time. Further studies are needed to create new procedures preventing cryoinjury on sperm. Especially, to protect sperm motility and vitality, as they were strongly influenced by cryoconservation.