Etablierung eines Immun-Monitoring-Assays für die dendritische Zellvakzinierung bei Glioblastom

Abstract

Das Glioblastom gilt als häufigste maligne hirneigene Neoplasie des erwachsenen Menschen. Unter bisheriger Standardtherapie können betroffene Patienten mit einer mittleren Überlebens-wahrscheinlichkeit von 14,6 Monaten rechnen. Die dendritische Zell-Vakzinierung ist eine neue Therapiemöglichkeit zur Behandlung von Tumoren wie dem Glioblastom, die nachweislich zu einer Verlängerung der mittleren Überlebensdauer führt. Obwohl eine immer größere Anzahl an Studien und Behandlungen diese Methode nutzt, mangelt es an Möglichkeiten, die immunologischen Abläufe im Rahmen der Therapie zu analysieren und zu bewerten. Ziel dieser Arbeit war es daher, einen Monitoring-Assay zu etablieren, um die immunologische Antwort von Patienten im Rahmen der DC-Vakzinierung zu messen. Der Monitoring-Assay konzentriert sich dabei auf die Analyse von T-Zellen als Haupt-Effektorzellen der Anti-Tumor-Antwort im Rahmen der Immuntherapie mit dendritischen Zellen. Die T-Zellen wurden durch eine Kombination von Real-Time-PCR und Durchflusszytometrie untersucht. Die Real-Time-PCR diente zur sensitiven Messung der IFN-γ-Expression, welche im Falle einer immunologischen Aktivierung ansteigt. Bei der durchflusszytometrischen Untersuchung der T-Zellen wurden neben der Analyse von Zell-Oberflächenmolekülen auch intrazelluläre Moleküle untersucht und mit einer Multimer-Färbung auch tumorantigen-spezifische T-Zellen erfasst. Somit erlaubte der Assay sowohl eine phänotypische als auch eine funktionelle Beurteilung der T-Zellen. Zur Etablierung des Verfahrens wurden Zellen von gesunden Blutspendern, Glioblastom-Patienten unter Standardtherapie und Glioblastom-Patienten, die mit der dendritischen Zellvakzinierung behandelt wurden, vergleichend untersucht. Außerdem wurden mehrere Peptide bezüglich ihrer Immunogenität analysiert, um ihren Stellenwert als Ziel-Antigene im Rahmen der DC-Vakzinierung beurteilen zu können. Im Rahmen der Arbeit konnte gezeigt werden, dass der vorgestellte Monitoring-Assay dazu geeignet ist, die immunologischen Abläufe der DC-Vakzinierung zu messen und die Immunogenität einzelner Ziel-Antigene zu beurteilen.

Glioblastoma is the most frequent and the most aggressive brain tumor in adults. Under standard course of therapy patients have a mean survival time of 14.6 months. Dendritic cell vaccination is a new therapeutic option for cancer, such as glioblastoma, which showed an improvement in mean survival time in clinical trials. Although a growing number of studies and applications of the DC-vaccination have been published, there is still need for assays to analyse and evaluate the immunological response caused by the therapeutic approaches. Our study aimed to establish a monitoring assay which makes it possible to measure the tumor-specific immunological response of DC-vaccinated patients. T cells are mainly responsible for the elimination of tumor cells. Therefore, the established monitoring assay focuses on analysing T cells. The cells were characterised by a combination of real-time-PCR and flow cytometry. IFN-γ expression as a measure of immunological response was analysed with sensitive real-time-PCR. Flow cytometry was used to measure molecules on the cell surface as well as intracellular. Additionally, multimer staining was performed to identify tumor-peptide specific T cells. As a combination of these methods, the monitoring assay made it possible to evaluate the phenotype and function of T cells. To establish the monitoring assay, cells from healthy blood donors, glioblastoma patients under standard course of therapy and glioblastoma patients who underwent DC-vaccination have been analysed. Additionally, several peptides have been analysed and their possibility to generate a cytotoxic immune response has been evaluated. Altogether, a monitoring assay for patients under DC-vaccination was successfully established. We were able to demonstrate that this assay is suitable to measure the cellular immune response of DC-vaccinated patients. In addition, the assay helps in evaluating possible new antigens to be included for this therapy.