Expressions- und Mutationsanalyse des ß-Catenin-Signalweges im juvenilen Angiofibrom

Abstract

Zielsetzung Das juvenile Angiofibrom ist ein gutartiger, fibrovaskulärer Tumor mit einem meist aggressiven Wachstum, der nahezu ausschließlich bei männlichen Jugendlichen auftritt. Über die Ätiologie dieser seltenen, gefäßreichen Neoplasie ist bislang wenig bekannt. Der WNT-Signalweg und das zugehörige Protein ß-Catenin scheinen eine wichtige Rolle in der Tumorpathogenese des juvenilen Angiofibroms zu spielen. Neben der Beobachtung, dass in 75 % der untersuchten Angiofibrome ß-Catenin-Mutationen im Bereich der Glykogensynthase-Kinase 3ß-Bindungsstelle vorliegen, wurden erhöhte ß-Catenin- Proteinlevel nachgewiesen (Zhang et al., 2003, Abraham et al., 2001). Glykogensynthase- Kinase 3ß ist ein Regulator, der ß-Catenin mittels Phosphorylierung zum Abbau markiert, was die Vermutung nahe legt, dass der erhöhte ß-Catenin-Proteinspiegel durch eine verlängerte Halbwertszeit der Proteine hervorgerufen wird. In dieser Arbeit sollten zum einen die bereits bekannten Mutationen im ß-Catenin-Gen überprüft, und zum anderen nach weiteren Mutationen im ß-Catenin-Gen und im Axin2-Gen gesucht werden, da Axin eine wichtige Funktion als Brückenprotein im WNT-Signalweg inne hat. Ein weiteres Ziel war die erste quantitative Bestimmung der ß-Catenin Transkripte, sowie der Transkripte, der an der Regulation von ß-Catenin beteiligten Faktoren Glykogensynthase-Kinase 3ß, Adenomatous polyposis coli, Axin1 und Axin2. Abschließend sollte die Expression der genannten WNTSignalweg- Proteine in Tumorgewebe und in Zellkulturen geprüft werden. Methoden Von fünf Tumorgeweben und zwei gesunden Referenzgeweben wurde Ribonukleinsäure isoliert, in komplementäre Desoxyribonukleinsäure umgeschrieben und mittels direkter Sequenzierung auf Mutationen in den Genen ß-Catenin und Axin2 untersucht. Um eine hierbei aufgefallene Deletion im Axin2-Gen genauer zu charakterisieren, wurde das entsprechende Polymerasekettenreaktion-Produkt kloniert und sequenziert. Ferner wurde eine quantitative Real-Time-Polymerasekettenreaktion für die Gene ß-Catenin, Glykogensynthase-Kinase 3ß, Adenomatous polyposis coli, Axin1 und Axin2 durchgeführt. Zur Expressionsanalyse der entsprechenden Proteine wurden immunhistochemische Färbungen mit 3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid an zuvor in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten von acht Angiofibromen und zwei Normalgeweben angefertigt. Des Weiteren wurden Immunfluoreszenzfärbungen mit einem ß-Catenin-Antikörper an Zellkulturreihen von drei Angiofibrom- und drei gesunden Hautfibroblasten-Zellreihen durchgeführt. Ergebnisse In vier von fünf Tumoren wurden sowohl bereits bekannte, als auch nach unserem Wissen für juvenile Angiofibrome nicht vorbeschriebene ß-Catenin Punktmutationen nachgewiesen, die zu einem Austausch eines von Glykogensynthase-Kinase 3ß phosphorylierten Serinrestes oder einer Aminosäure in dessen unmittelbarer Nähe führen. Im Axin2-Gen konnte eine bislang nicht bekannte Spleißvariante (Nukleotid 342 bis 457) detektiert werden, weitere Mutationen konnten im untersuchten Bereich nicht gezeigt werden. Zugleich wurden deutliche Unterschiede im Expressionsmuster der betrachteten Gene beobachtet. Vier von fünf Tumoren zeigten teils deutlich erhöhte Transkriptmengen an ß-Catenin, Glykogensynthase-Kinase 3ß, Adenomatous polyposis coli und Axin2 im Vergleich zum Normalgewebe. Des Weiteren konnten mittels immunhistochemischen Färbungen mit 3,3’- Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid verstärkte Proteinexpressionen von ß-Catenin und Axin2 im juvenilen Angiofibrom nachgewiesen werden. Die Immunfluoreszenz-Färbungen der Zellkulturreihen mit einem ß-Catenin-Antikörper zeigten keine Unterschiede zwischen Angiofibrom- und Normalgewebe-Zellreihen, bei beiden waren die Zellmembranen und teils auch das Cytoplasma stark angefärbt. Schlussfolgerung In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass verschiedene Mechanismen zu erhöhten ß- Catenin-Proteinleveln im juvenilen Angiofibrom führen, was für eine hohe Relevanz des WNT-Signalwegs in der Tumorpathogenese spricht. Neben dem Nachweis bekannter, sowie im juvenilen Angiofibrom neu aufgezeigter ß-Catenin-Mutationen, konnte eine neue Spleißvariante im Axin2-Gen identifiziert werden, welche ebenfalls zur Stabilisierung von ß- Catenin führen könnte. Erhöhte Transkriptlevel der WNT-Weg-Gene ß-Catenin, Glykogensynthase-Kinase 3ß, Adenomatous polyposis coli und Axin2 verdeutlichen die Bedeutung des WNT-Signalwegs beim juvenilen Angiofibrom.

Objective Juvenile angiofibromas is a benign fibro-vascular, mostly aggressive growing tumor occurring almost exclusively in adolescent males. Little is known about the pathogenesis of this rare tumor. The WNT-pathway and its associated protein ß-catenin seem to play a pivotal role in tumor biology. In addition to the frequent finding of ß-catenin mutations at the glykogen synthase kinase 3ß phosphorylation site in 75 % of analyzed juvenile angiofibromas, high levels of ß-catenin protein were scientifically proven (Zhang et al., 2003, Abraham et al., 2001). Glykogen synthase kinase 3ß is a regulator, marking ß-catenin for its degradation through phosphorylation. The loss of ß-catenin phosphorylation due to the detected mutations is the suggested reason for the increased ß-catenin protein levels. The aim of this study was to examine already known mutations of ß-catenin as well as to search for further ß-catenin and Axin mutations. Axin is known as an important scaffolding protein within the WNT-pathway. Furthermore, we aimed to determine the first quantitative analysis of ßcatenin transcripts and the WNT-pathway members glykogen synthase kinase 3ß, adenomatous polyposis coli, Axin1 and Axin2. Lastly, the expression of WNT-pathway proteins in tumor tissues and cell-cultures were analyzed. Methods Ribonucleic acid was isolated from five tumors and two normal control tissues, transcribed into complementary deoxyribonucleic acid, and subsequently analyzed by direct sequencing to determine whether mutations for the genes ß-catenin and Axin2 exist. Once a deletion in Axin2 was found, the corresponding polymerase chain reaction product was cloned and sequenced for its characterisation. Expression of the WNT-pathway genes ß-catenin, glykogen synthase kinase 3ß, adenomatous polyposis coli, Axin1 and Axin2 was further measured by quantitative real-time polymerase chain reaction. Additionally, paraffin embedded tissue of eight juvenile angiofibromas and two normal control tissues was analyzed immunohistochemically using 3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloride to examine the expression of the corresponding proteins. Furthermore, immunofluorescence staining using ß-catenin antibodies was performed on three cultured tumor and three normal dermal fibroblast lines. Results The mutation analysis detected already known ß-catenin point mutations as well as mutations not yet described, to the best of our knowledge, in juvenile angiofibromas in four out of five tumors. These mutations lead to an exchange of the serine residues phosphorylated by glykogen synthase kinase 3ß or an amino acid in its close proximity. In addition, a so far unknown transcribed Axin2 splice variant (nucleotide 342 to 457) was identified, but no further Axin2 mutations. Furthermore, clear differences between the patterns of expression of the examined transcripts were observed. Four out of five tumors showed in part a substantial increase in transcripts of ß-catenin, glykogen synthase kinase 3ß, adenomatous polyposis coli and Axin2 in comparison to normal tissue. Using 3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloride for immunohistochemical staining in juvenile angiofibromas showed an increased expression of ß-catenin and Axin2 proteins. The location and intensity of immunofluorescence staining using ß-catenin antibodies in cultured tumor and normal tissue cell lines were identical, both showed strong staining of cell membranes and cytoplasm. Conclusion This study supports the importance of aberrant WNT-signaling as a common event in the pathogenesis of juvenile angiofibromas. Various mechanisms seem to be responsible for the increased levels of ß-catenin protein in the expression of this tumor. In addition to the frequent ß-catenin mutations, a so far unknown Axin2 splice variant was found, which could result in a further stabilization of the ß-catenin protein. Besides the loss of phosphorylation, the finding of increased transcript levels of the WNT-pathway members ß-catenin, glykogen synthase kinase 3ß, adenomatous polyposis coli and Axin2 suggests additional factors being responsible for the increased levels of ß-catenin protein in juvenile angiofibromas.