Mechanische und hormonelle Regulation von Kalzium in Erythrozyten

Abstract

In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse in Bezug auf das funktionelle Verhalten von Erythrozyten bei mechanischer und hormoneller Stimulation kalziumionenabhängiger Prozesse gezeigt. Kalziumionen sind auf Grund des Gradienten zwischen Zytosol und extrazellulärer Umgebung ein wichtiger Aktivator für intrazellulärer Prozesse. Durch die Aktivierung von mechanosensitiven Kationenkanälen, wie beispielsweise Piezo-1 kann in Sekundenschnelle eine Signalkaskade in Bewegung gesetzt werden, welche die Flexibilität und das Volumen der Zelle der Umgebung anpasst und es somit der Zelle ermöglicht Engstellen, z.B. im kapillaren Blutfluss oder den Milzsinusoiden, zu passieren. Auch durch körpereigene Hormone lässt sich der Kalziumioneneinstrom beeinflussen. Im Fokus dieser Arbeit stand dabei die hormonelle Stimulation verschiedener TRPC-Kanäle durch Prostaglandin E2 und Erythropoetin. Die Arbeit teilte sich wie folgt in drei Teilprojekte. Das erste Teilprojekt zeigte zunächst, dass es durch osmotischen Druck auf reife Erythrozyten zu einem Kalziumioneneinstrom in die ruhende Zelle kommt. Dieses Signal konnte durch Zugabe eines Inhibitors für mechanosensitive Kationenkanäle unterbunden werden. Auch ein direkter mechanischer Druck auf die Zellmembran mittels Glaspipette führte zu einem Einstrom von Kalziumionen in den Erythrozyten, welcher ebenfalls durch die Inhibition mechanosensitiver Kationenkanäle unterdrückt werden konnte. Zum Abschluss dieses ersten Teilprojektes konnte zum ersten Mal mit Hilfe von künstlichen Kapillarsystemen das funktionelle Verhalten von Erythrozyten bei der Passage von Engstellen im Zusammenhang mit dem Einfluss von Kalziumionen gezeigt werden. Die Ergebnisse dieser Versuche dienen als Grundlage für weitere Experimente, wie beispielsweise Mausmodelle bei denen mittels Rückenhautkammer der einzelne Erythrozyt in vivo bei der Passage kapillarer Engstellen, in Bezug auf die Änderung der intrazellulären relativen Kalziumionenkonzentration, gemessen werden kann. Hierdurch erhoffe ich mir in Zukunft neue Erkenntnisse im Bezug auf seltene Anämien, wie der hereditären Xerozytosis, welche mit einer Mutation des Piezo-1 Gens assoziiert ist. Im zweiten Teilprojekt konnte gezeigt werden, dass sowohl mechanosensitive Kationenkanäle, als auch Gardoskanäle die Filtrierbarkeit von Erythrozyten beeinflussen. Eine Inhibition der beiden Kanäle zeigte dabei eine schlechtere Filtrierbarkeit der Erythrozyten durch einen Zellulosefilter, als die native Kontrollprobe. Dieses experimentelle Verfahren könnte dabei, durch weitere Optimierung in Folgeexperimenten, der schnellen und kostengünstigen Ermittlung der Filtrierbarkeit von Erythrozyten dienen. Auch Krankheiten, welche die Filtrierbarkeit von Erythrozyten beeinflussen, könnten mit diesen einfachen Verfahren schnell und effizient diagnostiziert werden. Das letzte Teilprojekt zeigte die hormonelle Stimulation von TRPC-Kanälen auf Erythrozyten mittels Prostaglandin E2 und Erythropoetin. Dabei dienten gesunde Spendererythrozyten, Wildtyp- Mauserythrozyten, sowie drei Gruppen von verschiedenen TRPC Knock-Out Mauserythrozyten als Versuchsproben. Durch Messung der hormonell stimulierten Kalziumsignaländerung der jeweiligen Gruppen, konnten bereits bekannte Effekte der TRPC Kanäle beim Menschen bestätigt werden. TRPC Kanäle sind hauptverantwortlich für den Prostaglandin E2 stimulierten Kalziumioneneinstrom beim Menschen. Dieser Einstrom konnte durch Erythropoetin inhibiert werden. Des Weiteren zeigte sich besonders durch Vergleich der Erythrozyten von Wildtyp-Mäusen und TRP C4/C5 Knock-Out Mäusen mit humanen Spendererythrozyten, dass zumindest funktionell bei reifen menschlichen Erythrozyten keine aktiven TRP C4/C5 Kanäle in der Membran vorhanden sind. Sowohl die hormonelle Stimulation der TRP C4/C5 Kanäle mit Prostaglandin E2, als auch mit Erythropoetin führte in meinen Experimenten zu einem Kalziumioneneinstrom in den murinen Erythrozyten. Diese Erkenntnisse nähren Zweifel, dass Wildtyp-Mäuse ein geeignetes Modell zur hormonell stimulierten Kalziumsignalmessung im Bezug auf TRPC-Kanäle beim Menschen darstellen.

This scientific work shows current findings in relation to the functional behaviour of red blood cells by mechanical and hormonal stimulation of Ca2+-dependent processes. Due to it’s gradient across the plasma membrane Ca2+ is an important activator of intracellular processes. A stimulation of mechanosensitive cation channels, such as Piezo-1, leads to a rapid Ca2+ influx, which activates a singnaling cascade which quickly changes volume and flexibility of the red blood cells. This enables them to pass constrictions like the capillary system or splenic sinusoids. Also endogenous hormones have an effect on Ca2+ influx. This work focuses on hormonal stimulation of TRPC-channels in presence of Prostaglandine E2 and Erythropoetin. The whole dissertation is divided in three parts. At the beginning of the first part Ca2+ influx is provoked by osmotic pressure on the membrane of resting red blood cells. This influx can be suppressed by adding an inhibitor of mechanosensitive Ca2+-channels. Also direct mechanical pressure on the RBCs membrane by a glass pipette leads to a Ca2+ influx, which also can be blocked after incubating red blood cells with this inhibitor. For the first time the functional behaviour of erythrocytes in correlation with the influence of Ca2+ can be shown by red blood cells passing constrictions in an artificial capillary system. The findings of this part can be the basics for future experiments, in particular mouse models with dorsal-skin preparation, which shows single red blood cells passing constrictions in vivo. As a result I expect new knowledge in relation to rare anaemias like hereditary Xerocytosis which is associated with mutations in the Piezo-1 gene. The second part of the project shows an influence of mechanosensitive channels and Gardoschannels on filtration of red blood cells. An inhibition of these channels shows a decrease in filterability in comparison to a control group. After some optimisation in future experiments this experimental method could be used as a quick and efficient instrument for filterability issues on red blood cell suspensions. Also diseases, which affect the filterability of red blood cells could be diagnosed quickly and low-priced. The last part refers to the hormonal stimulation of TRPC-channels due to Prostaglandin E2 and Erythropoetin. Human red blood cells, wildtype-mouse RBCs and RBCs of three different groups of TRPC knock-out mice were tested and compared. Measurements of changes in intracellular Ca2+ in these groups confirm already known effects of hormonal stimualtion of TPRC channels in human red blood cells. TRPC channels are responsible for an Prostaglandin E2-dependent influx of Ca2+ in human red blood cells. This influx can be inhibited by Erythropoetin. Futhermore comparing wildtype-mouse RBCs with TRP C4/C5 mouse erythrocytes and human red blood cells shows, that there is no functional active TRP C4/C5 channel on surface of adult human RBCs. Both hormonal stimulation with Prostaglandin E2 and Erythropoetin activating TRP C4/C5 leads to an increase of intracellular Ca2+ in murine erythrocytes. These results suggest that wildtype-mice red blood cells aren’t an adequate model for hormonal stimulated Ca2+ measurements caused by TRPC-channels to compare with human red blood cells.