Lokalisation und Funktion von KDEL-Rezeptoren in Hefe- und Säugerzellen

Abstract

A/B toxins such as cholera toxin, Pseudomonas exotoxin and yeast killer toxin K28 contain a KDEL-like motif at either subunit which ensures retrograde toxin transport through the secretory pathway of a target cell. Intoxication and host cell entry is initiated by toxin binding to plasma membrane (PM) receptors where the yeast KDEL receptor (KDELR) was recently identified as receptor of K28. Consistent with its function at the cell surface, electron microscopy was performed to support PM co-localization of KDELRs in yeast and mammals. To identify how a major KDELR fraction is retained in the secretory pathway, the C-terminal lysine cluster of KDELRs was confirmed to play an important role for ER retention in yeast and mammalian cells. As KDELRs function as GPCRs in the regulation of vesicle trafficking, a similar signalling function after cargo binding at the cell surface is assumed. To address such novel functions, CRISPR/Cas9-mediated KDELR knock-out (KO) cell lines were generated. While KDELR1-KO inhibited HEK293 cell survival, the generation of KDELR2- and KDELR3-KO cell lines was successful. Characterization of commercial KDELR1-KO HAP1 cells revealed a strong sensitivity under ER stress conditions and an increased secretion of PDI. Additionally, transcriptome analysis showed alterations in the expression of genes whose products are involved in developmental processes, cell adhesion and extracellular matrix functions.

A/B-Toxine wie das Cholera-Toxin, Pseudomonas-Exotoxin und das Hefe-Killertoxin K28 enthalten ein KDEL-ähnliches Motiv an einer ihrer Untereinheiten, welches den retrograden Toxintransport durch den Sekretionsweg der Zielzelle ermöglicht. Ihr Eindringen wird durch die Bindung an Plasmamembran (PM)-Rezeptoren initiiert, wobei der KDEL-Rezeptor (KDELR) als PM-Rezeptor von K28 identifiziert werden konnte. Im Zusammenhang mit dieser Funktion an der Zelloberfläche wurde eine Co-Lokalisation des KDELR in der PM von Hefe- und Säugerzellen durch Elektronenmikroskopie bestätigt. Untersuchungen bezüglich der KDELR-Retention im Sekretionsweg konnten eine entscheidende Rolle des C-terminalen Lysin-Clusters in Hefe- und Säugerzellen bestärken. Da KDELRs bei der Regulation von Transportprozessen als GPCRs agieren, kann auch eine ähnliche Signalfunktion nach extrazellulärer Ligandenbindung angenommen werden. Zur Analyse solch neuer Funktionen wurden mittels CRISPR/Cas9-Technologie KDELR-KO Zelllinien hergestellt. Während die Generierung eines KDELR2- und KDELR3-KOs gelang, verhinderte der KDELR1-KO das Überleben von HEK293-Zellen. Die Charakterisierung einer kommerziellen KDELR1-KO HAP1-Zelllinie zeigte eine erhöhte Sensitivität bei ER-Stress sowie eine verstärkte PDI-Sekretion. Zusätzlich konnten mittels Transkriptomanalyse Veränderungen in Entwicklungsprozessen, Zelladhäsion sowie Komponenten der Extrazellulären Matrix nachgewiesen werden.